近日，由西北工业大学生命学院尹大川教授生物大分子研究室和骞爱荣教授骨代谢研究室组成的联合研究团队在RNA递送载体领域取得重要进展。团队研究发现阳离子型高分子聚乙烯胺（polyvinylamine,PVAm）可用于多种RNA的体外和体内递送，具有转染效率高、安全性好、经济性好等优势，相关研究成果发表于药学顶级学术期刊JournalofControlledRelease（,,20-37）上。
当前RNA药物研发的主要瓶颈在于递送载体较难同时满足对安全性和有效性的严格要求。经典的聚乙烯亚胺（PEI）载体因与核酸分子间较强的结合能力和胞内“质子海绵效应”的存在而具备较高的转染效率，但同时其细胞*性也较强。而聚乙烯胺（PVAm）与RNA之间亲和力适中，兼具胞内的“质子海绵效应”，既可有效保护RNA在循环过程中不被降解，又能促进RNA的胞内高效释放。图1使用PVAm作为RNA递送载体示意图
实验中所使用的PVAm为聚N-乙烯甲酰胺（PNVF）的部分水解产物，根据1H-NMR、FTIR等表征数据，该PVAm约90%的侧链为氨基，约10%的侧链为甲酰胺基（少部分脱水成环），其分子结构式如图1所示；由GPC测得的数均分子量Mn约为57.7kDa，重均分子量Mw约为73.2kDa，由MALDI-TOFMS测得的数均分子量Mn约为65.6kDa。
PVAm与r/miR-34a在DEPC水溶液中也可形成稳定的纳米复合体PVAm
r/miR-34a；PVAm与siRNA或miRNA在类似条件下均可形成复合体。不同的高分子/RNA质量比条件下形成的PVAmr/miR-34a复合体的尺寸均小于nm且尺寸较为均一，具备通过EPR效应进入肿瘤细胞的能力。当PVAm/RNA质量比为1:2和1:1时，纳米复合体表面电荷接近中性，携带微弱的正电荷，既有利于避免血液循环中发生非特异性结合，也有利于复合体进入细胞。相比而言，不同配比的PEIr/miR-34a颗粒均带有较强的正电荷，在体内易出现非特异性结合，还存在细胞*性风险。透射和扫描电镜可观察到该纳米复合体呈均一规则的球形（图2A）。PVAm
r/miR-34a复合体在不同盐浓度和不同pH环境下尺寸较为恒定，颗粒较小（图2BC）。相比而言，线型PEI与r/miR-34a仅在特定的盐浓度和pH范围内可形成较小的颗粒，其对环境的适应范围不及PVAm。琼脂糖凝胶电泳的结果显示PVAm和PEI均可在一定浓度比例下紧密结合RNA（图2D），但是在有血清条件下，PVAmr/miR-34a可稳定存在12小时以上（图2E），而PEIr/miR-34a仅可稳定约3小时，因此在血液环境中PVAm对RNA的保护效果优于线型PEI。图2.PVAm、线型PEI与重组RNA(r/miR-34a,mer)形成的纳米复合物的理化性质对比.(A)纳米复合物的透射电镜(上)、扫描电镜(下)照片.(B)不同NaCl浓度下纳米复合物的流体动力学直径.(n=3).(C)不同pH条件下纳米复合物的流体动力学直径.(n=3).(D)纳米复合物在1%琼脂糖凝胶电泳中的迁移情况.(WR：高分子/RNA质量比).(E)小鼠血清处理不同时间后的纳米复合物在1%琼脂糖凝胶电泳中的迁移情况.I:裸r/miR-34a，II:PEIr/miR-34a，III:PVAmr/miR-34a.PVAm与r/miR-34a形成稳定纳米复合体，其细胞转染效率在人骨髓瘤B细胞上进行验证。经PVAm
r/miR-34a处理后，B细胞内的miR-34a表达量增加超过倍（图3A），证明其已有效导入细胞，而miR-34a的目标基因所对应的蛋白CDK6和SIRT1的表达量则显著下降（图3B），且比Lipofectamine?0和线型PEI载体递送r/miR-34a导致的下降程度更大。miR-34a是一种较强肿瘤抑制剂，可抑制肿瘤的生长，还可引发多种肿瘤细胞的凋亡（CellDeathDis.,,5,e）。5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色可进行细胞增殖检测分析，由PVAm将r/miR-34a递送至B细胞后，EdU染色阳性的细胞显著减少（图3C），显示其增殖受到了强烈抑制，且抑制效率明显高于PEI组。Caspase3免疫荧光染色显示经PVAm
r/miR-34a处理后的B细胞凋亡比例显著增高（图3D）。由浓度-抑制率曲线得到的PVAmr/miR-34a组的EC50值为7.5nM（图3E），远低于PEIr/miR-34a组的28.6nM。综合以上结果，PVAm递送r/miR-34a相比于线型PEI具有更高的体外转染效率和抑制肿瘤细胞增殖的生物学效应。图3.PVAm、线型PEI携带重组RNA(r/miR-34a)体外转染人骨肉瘤B细胞.(A)茎环RT-qPCR检测PVAm携带r/miR-34a转染B细胞的RNA表达量与线型PEI的对比.(B)30nMr/miR-34a转染B细胞后Westernblot检测CDK6与SIRT1蛋白的表达量.CDK6和SIRT1均为miR-34a的目标蛋白.(C)r/miR-34a转染B细胞的EdU肿瘤细胞增殖荧光染色及定量结果(绿色为EdU阳性细胞，蓝色为细胞核，比例尺=μm).MSA为tRNAMet融合Sephadex适配体，作为r/miR-34a的无功能阴性对照.(D)r/miR-34a转染B细胞的细胞凋亡标记Caspase-3免疫荧光染色及定量结果.(红色为Caspase-3，蓝色为细胞核，比例尺=25μm).***p0..(E)浓度相关的PVAm携带r/miR-34a转染B细胞对肿瘤细胞增殖活性的抑制作用与线型PEI对比.MSA为tRNAMet融合Sephadex适配体，作为r/miR-34a的无功能阴性对照.为了测试PVAm体内递送RNA的效果，动物实验采用前期实验中成功递送的PVAm
r/miR-34a，动物模型为异种移植B骨肉瘤小鼠模型，肿瘤细胞接种及PVAmr/miR-34a经静脉注射系统性给药的时间表见图4A。实验结果显示PVAmr/miR-34a可显著抑制小鼠骨肉瘤的生长（图4BC）。作为对照的PEIr/miR-34a复合物也一定程度上抑制骨肉瘤的生长，但抑制程度不及PVAmr/miR-34a，在一只被试小鼠中还出现了肺转移现象。免疫组化结果显示PVAmr/miR-34a组相比PEIr/miR-34a组出现了更多肿瘤组织坏死（图4D），且miR-34a的主要标靶SIRT1的表达量得到显著抑制（图4E），显示出较好的肿瘤抑制效果；对动物体重的监测发现PVAmr/miR-34a组体重无显著减轻（图4F），但采用PEI为递送载体的组体重均显著降低，且出现两只实验动物死亡。综上，PEI在体内实验中体现出显著的副作用，而PVAm作为递送载体更为安全有效。血液生化指标中，PVAm组谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）水平均在正常范围内，指示炎症水平的细胞因子白介素6（IL-6）水平与空白对照组相当，显示出PVAm递送系统具备较好的体内安全性，未引起明显的肝肾功能改变和免疫反应。图4.小鼠静脉注射PVAm携带重组RNA(r/miR-34a,1mg/kg)对骨肉瘤生长的抑制作用.骨肉瘤为B细胞原位异种移植模型.(A)小鼠骨肉瘤接种及注射PVAmr/miR-34a时间表.(B)注射PVAm携带r/miR-34a对小鼠骨肉瘤生长情况的影响与PEI对比.左图为小鼠腿部肿瘤组织照片，右图为D-荧光素活体生物荧光成像造影.(C)肿瘤组织的体积随时间的变化.(*p0.05,two-wayANOVA).(D)肿瘤组织的HE染色.(×，N:肿瘤坏死部分).(E)免疫组化染色显示去乙酰化酶SIRT1在肿瘤组织中的表达.(E)小鼠体重随时间的变化.(*p0.05,two-wayANOVA).MSA为tRNAMet融合Sephadex适配体，作为r/miR-34a的无功能阴性对照.为进一步测试PVAm体内递送RNA的效果，RNA采用靶向mmu-Apo脂蛋白B（ApoB-）的重组siRNA（r/si-ApoB），动物模型为高脂饮食诱导高血脂小鼠模型。从体内递送的结果来看，递送PVAm
r/si-ApoB可以显著降低肝内的脂肪含量（图5A），同时肝内ApoB-的表达受到显著的抑制（图5BC），肝内成熟的si-ApoB表达量显著增加（图5D）。此外，递送PVAmr/si-ApoB可以大幅低高脂饮食小鼠的血脂水平，其中甘油三酯（TG）降低效果最为显著，低密度胆固醇水平也降低至正常饮食小鼠的水平。饲喂高脂饮食11周后连续9周注射PVAmr/si-ApoB并未引起小鼠体重的明显变化（图5E），血液生化指标中指示炎症水平的细胞因子白介素6（IL-6）水平与空白对照组基本相当（图5F），谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）水平均在正常范围内（图5G）。综合以上结果，递送PVAmr/si-ApoB显示出显著的高血脂治疗效果，短期内具备一定的体内安全性。图5.高脂饮食诱导高血脂小鼠尾静脉注射PVAmr/si-ApoB(1mg/kgr/si-ApoB)降低血脂的效果.(A)油红O脂肪组织染色染色.(B)肝组织内ApoB-的免疫组化染色.(C)RT-qPCR测试肝组织内ApoB-mRNA表达量.(D)RT-qPCR测试肝组织内成熟si-ApoB的表达量.*P0.05,***P0.(one-wayANOVA,与MSA组对比).(E)小鼠体重随时间变化曲线.(F)小鼠血清IL-6表达水平.(G)小鼠血液谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CR）水平(n=3,虚线代表正常范围).研究结果表明，PVAm可向各类细胞递送不同大小的RNA（siRNA、miRNA和重组RNA等），具有优于目前商品化的Lipofectamine0和INTERFERinPEI的转染效果，且细胞*性较低。以PVAm为载体向异种移植人骨肉瘤小鼠体内递送miR-34a，对肿瘤生长有显著的抑制效果；向高脂饮食诱导高血脂小鼠体内递送si-ApoB，可显著降低小鼠的血脂水平；同时，PVAm递送体系对两种模型动物的肝肾功能均无明显影响，也无明显的免疫原效应。
此外，PVAm作为一种工业上常用的大宗化学品，其价格远低于现有的商业化RNA载体。因此，本项目的研究成果将为下一代RNA药物研发提供了一种高效、低*、经济的候选载体。
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