杨乾坤,陈通,王巍,等.骨肉瘤预后相关的临床预测指标[J].中华肿瘤杂志,,43(5):-.DOI:10./cma.j.cn--.
骨肉瘤又称成骨肉瘤，是起源于间叶组织的原发性恶性肿瘤，主要好发于儿童和青少年。在过去的50年中，骨肉瘤的治疗方式几乎未发生明显变化，治疗进入平台期。约35%～45%的骨肉瘤患者存在化疗耐药、治疗反应性低等情况，这部分患者极易发生远处转移。而发生远处转移的患者，5年生存率不足20%[1]。虽然寻找有效的治疗方法是目前骨肉瘤研究的重点，但是可靠的疾病预测指标或评估系统在评价治疗反应、支持临床决策、监测疾病复发转移、估计远期生存等方面也具有重要临床价值。近年来，随着基因组学、蛋白组学、转录组学、代谢组学等技术的发展，有关血清标志物、外周血细胞成分、肿瘤组织或外周血中的蛋白成分或核酸成分等一系列生物指标与骨肉瘤预后关系的研究也逐渐增多。虽然大多数指标与骨肉瘤预后存在统计学意义，但是在临床实践中这些指标检测手段复杂、推广使用困难，因此如何选择简单有效可靠的临床预测指标仍是一个难题。我们现对骨肉瘤的预后相关临床预测指标作一系统总结，为临床实践提供一定的参考。一、骨肉瘤预后相关临床预测指标的分类
通过对中、英文数据库进行系统文献检索和归纳总结，并结合预测指标的检测手段、表达部位、成分划分等，可将骨肉瘤的预后相关临床预测指标大致分为9大类，即蛋白成分、核酸成分、营养指标、炎性指标与炎症-营养综合性指标、外周血细胞成分与非细胞成分、肿瘤微环境构成成分、影像学指标、代谢组学相关指标和疾病临床特征。
二、各类预测指标与骨肉瘤预后的关系
(一)蛋白成分
骨肉瘤是一种基因广泛突变的疾病，因此必然会出现一系列的差异性表达基因，调控表达一系列异常蛋白成分，其中很多蛋白成分必然与骨肉瘤的预后存在一定的相关关系。近年来，随着芯片技术和转录组学技术的快速发展，通过对骨肉瘤进行基因差异性表达分析，发现了众多与骨肉瘤预后相关的蛋白成分，这些蛋白多达数百种，且大多数蛋白表达与骨肉瘤预后呈负相关，如环氧化酶2[2]、细胞周期依赖蛋白激酶9[3]、P16蛋白[4]、P27蛋白[5]、程序性死亡受体配体1/程序性死亡受体1[6]、缺氧诱导因子1α[7]等。但由于目前骨肉瘤发病的关键驱动基因尚不明确，因此我们认为，这类指标虽然数量众多，但其作为骨肉瘤预后预测指标的临床价值较低。
(二)核酸成分
1．微小RNA(microRNA，miRNA)：
miRNA是一类内生的、长度约为20～24个核苷酸的非编码单链RNA，其主要作用是参与基因表达的调控。每个miRNA可调控多个靶基因，而多个miRNA也可调节同一靶基因，从而构成了机体复杂的调控网络。人体内约1/3的基因均受miRNA的调控。研究显示许多miRNA与骨肉瘤患者的预后相关。例如：瘤体内miR-a[8]、miR-17[9]、miR-[10]、miR-21[11]、miR-[12]和miR-[13]等高表达，miR-[14]、miR-95-3p[15]、miR-[16]和miR-b[17]等低表达，均与骨肉瘤预后不良密切相关；血清中miR-[18]、miR-[19]、miR-[20]和miR-[21]等含量异常也是骨肉瘤预后不良的影响因素。总体而言，瘤体内或者外周血中miRNA的表达异常大多数与骨肉瘤预后不良有关，仅少部分miRNA的表达异常与骨肉瘤预后良好有关，如miR-[22]低表达、miR--3p[23]和miR--3p[24]高表达。
2．长链非编码RNA(longnon-codingRNA，lncRNA)：
lncRNA指长度超过个核苷酸的RNA分子，其上没有编码蛋白的阅读框。在细胞内，lncRNA的丰度约占70%～98%，有些lncRNA甚至长达几千bp。虽然lncRNA不编码任何蛋白质，但其表达在不同组织和发育阶段依然具有特异性，可参与机体X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多个生物学途经的调控过程。在骨肉瘤中，lncRNA表达水平的异常与患者的生存时间密切相关，绝大部分lncRNA表达异常与骨肉瘤患者的生存时间呈负相关。例如：长链非编码RNATP73反义RNA1[25]、长链非编码RNA羰基还原酶3反义RNA1[26]和INK4位点反义非编码RNA[27]等高表达，或上皮性卵巢癌转录因子2长链非编码RNA[28]和母系表达基因3长链非编码RNA[29]等低表达，均提示患者预后不良。
3．环形RNA分子(circularRNA，circRNA)：
circRNA是一类新的非编码RNA，它具有一种共价连接的闭环结构，主要产生于反向剪接或首位剪接事件中。circRNA广泛表达于组织中，具有发育阶段特异性和物种间的保守性。研究显示，一些circRNA能够在细胞质中充当miRNA海绵，或作为RNA结合蛋白的隔绝子、核内翻译的调控子，是基因表达调控网络的重要参与者[30]。circRNA与肿瘤发生、动脉粥样硬化、神经退行性疾病等病理过程密切相关。在骨肉瘤中，瘤体内circRNA表达量或外周血circRNA含量与患者的预后密切相关。外周血中circ_[31]、circ_[32]和hsa_circ_[33]等高表达，瘤体中circ-NT5C2[34]高表达和circ_HIPK3[35]低表达，均提示骨肉瘤患者预后不良。
(三)营养指标
营养状态不但与患者的手术和化疗耐受能力密切相关，也能影响患者的预后。改善患者的营养状态能够提高患者的总体预后，延长患者的生存时间。营养指标是骨肉瘤患者预后的非特异性指标。目前常见的营养状态评价指标包括体重、体质指数(bodymassindex,BMI)、上臂肌肉周径、三头肌皮皱厚度、蛋白成分(血红蛋白、血浆白蛋白、转铁蛋白)、老年营养风险指数(geriatricnutritionalriskindex,GNRI)、预后营养指数(prognosticnutritionalindex,PNI)、控制性营养状况评分等。
相关研究显示，确诊后6～12个月是骨肉瘤和其他软组织肉瘤患者营养不良最严重的时期[36,37]。约62%的儿童实体瘤患者在确诊时存在营养不良，BMI异常能显著降低Ewing肉瘤(HR＝3.46,P＝0.)和骨肉瘤(HR＝1.6,P0.)的总生存时间(overallsurvival,OS)[38]。低BMI组骨肉瘤患者治疗后发生感染的风险较高(OR＝2.0,P＝0.07)，而高BMI组骨肉瘤患者治疗后发生动脉栓塞的风险较高(OR＝9.4,P＝0.03)[39]。因此，术前纠正营养不良和特定时期进行营养干预将有助于改善骨肉瘤患者的预后，延长患者的生存时间。
PNI是临床上常用的营养评价指标，与骨肉瘤的预后相关。Huang等[40]通过受试者工作特征曲线分析确定PNI的最佳临界值为46.7，根据临界值将患者分为两组(PNI46.7组和PNI46.7组)。研究显示，与PNI46.7组的骨肉瘤患者相比，PNI46.7组的骨肉瘤患者具有肿瘤体积较大、Enneking分期较高、更易出现病理性骨折、高局部复发率和高远处转移率等特点，而且PNI46.7组骨肉瘤患者的预后也更差。GNRI是与PNI类似的营养评价指数，不但与老年住院患者的死亡率和围手术期并发症密切相关[41]，同时也是骨肉瘤患者预后的重要营养评价指标。
(四)炎性指标与炎症-营养综合性指标
炎症与肿瘤的发生、发展过程密切相关，且慢性炎症在诱发肿瘤发生的因素中约占25%[42]，因此炎性指标常是众多恶性肿瘤的非特异性预后指标。同样，炎性指标以及在此基础上衍生出的炎症-营养综合性指标也是骨肉瘤常见的非特异性预后指标，主要包括C反应蛋白(C-reactiveprotein,CRP)、C反应蛋白/白蛋白比值(C-reactiveprotein/albuminratio,CAR)、系统性免疫炎症指数、Glasgow预后评分(Glasgowprognosticscore,GPS)、改良GPS、高敏改良GPS、中性粒细胞/淋巴细胞比值(neutrophiltolymphocyteratio,NLR)、血小板/淋巴细胞比值(platelettolymphocyteratio,PLR)、淋巴细胞/单核细胞比值(lymphocytetomonocyteratio,LMR)和中性粒细胞-血小板评分(neutrophil-plateletscore,NPS)等。
Li等[43]报道，术前血清CRP1mg/dl的骨肉瘤患者预后明显差于CRP≤1mg/dl的患者，血清CRP水平是骨肉瘤预后的独立预测因素(HR＝2.39,95%CI为1.22～4.67)。Yi等[44]进行的Meta分析显示，CRP水平升高组骨肉瘤患者的OS明显短于未升高组患者(RR＝0.35，95%CI为0.18～0.68,P＝0.)。Li等[45]对CAR、GPS、NLR和PLR等4种炎性指标与骨肉瘤预后之间的关系进行了研究，多因素分析结果显示，CAR是骨肉瘤预后的独立预测因素(HR＝2.21，95%CI为1.40～3.49,P＝0.)。Liu等[46]则对CRP、GPS、NLR、PLR、LMR和NPS等6种炎性指标与骨肉瘤患者OS之间的关系进行了研究，Cox多因素回归分析显示，CRP、GPS、NLR和PLR值增加，或LMR值降低，均是骨肉瘤患者OS的不良预后因素；在预测效能上，GPS和NLR的准确性和鉴别力显著优于其他指标。Xia等[47]的研究也显示，NLR是骨肉瘤患者OS(HR＝1.80，95%CI为1.35～2.41,P0.)和无进展生存时间(HR＝1.65，95%CI为1.26～2.15,P0.)的独立危险因素。
(五)外周血细胞成分与非细胞成分
外周血中的某些成分也与骨肉瘤患者的生存预后密切相关，主要包括外周血细胞成分和非细胞成分。其中，细胞成分主要为正常的血细胞和循环的肿瘤细胞，非细胞成分包括从肿瘤组织中释放出来的蛋白成分、核酸成分(DNA、miRNA、lncRNA、circRNAs等)、炎性介质、趋化因子、酶等，包括碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、总胆固醇(totalcholesterol,TC)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)、血清淀粉样A、CXC趋化因子配体4、尿酸、D-二聚体等。这类预测指标较易检测，临床上运用较为广泛，但大多为非特异性指标。
研究显示，对于高风险Ewing肉瘤和儿童骨肉瘤，淋巴细胞绝对计数(absolutelymphocytecount,ALC)在治疗2周后快速恢复患者的预后较恢复不良的患者好[48,49]。与此类似，在接受顺铂和阿霉素治疗的儿童局限性肢体骨肉瘤患者中，治疗前ALC较高或者治疗2周后LMR较高者具有相对较长的OS和无病生存时间(disease-freesurvival,DFS)[50]。此外，在骨肉瘤动物模型中，贫血或红细胞降低、CD8+T/Treg比值降低均与OS缩短有关[51,52]。在EnnekingⅡB期骨肉瘤患者中，血红蛋白动态性持续下降或者血红蛋白下降值≥7.6g/L的患者预后明显较差[53]。血小板相关指标也可作为骨肉瘤患者的预后预测指标。有研究显示，平均血小板体积与血小板压积的比值≥43.58与骨肉瘤患者的DFS密切相关(HR＝0.，95%CI为0.～0.,P＝0.)[54]。
连续3项Meta分析研究结果均显示，血清ALP水平与骨肉瘤患者的OS和DFS呈负相关[55,56,57]。在骨肉瘤的狗动物模型中，高TC水平能显著降低动物的死亡率，表明TC也可以作为骨肉瘤的预后预测指标[58]。此外，血清中的尿酸值升高[59]、LDH值升高[60]、D-二聚体值增加[61]和基质金属蛋白酶9升高[62]等也与骨肉瘤患者预后不良密切相关。
(六)肿瘤微环境构成成分
肿瘤微环境(tumormicroenvironment,TME)是一个非常复杂的系统，主要由肿瘤细胞、基质细胞、基质成分、血管成分、各种免疫细胞等组成。肿瘤微环境内成分异常是骨肉瘤患者产生耐药的重要原因，也是患者预后不良的重要因素[63]。研究表明，骨肉瘤TME中肿瘤相关巨噬细胞(tumour-associatedmacrophages,TAMs)的比例增加能降低转移风险，延长患者的OS[64]。TME中CD+TAM和CD8+T细胞浸润增加的骨肉瘤患者预后更好[65]。巨噬细胞主要包括两种亚型，即经典激活型(M1型)和选择激活型(M2型)。其中，M1型巨噬细胞可由γ-干扰素等激活，介导Th1反应，主要发挥清除细胞内的病原体和杀灭肿瘤细胞的作用，因此被视为参与炎症反应和抗肿瘤免疫的关键细胞成分；而M2型巨噬细胞主要由白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)等激活，介导Th2反应，引起IL-10高表达和IL-12低表达，最终降低抗肿瘤活性。因此，M2型巨噬细胞被视为肿瘤浸润和转移的支持或促进细胞。在预后不良的转移性骨肉瘤中，其TME中的M1/M2比值存在显著失调，M1型巨噬细胞的比例显著降低，而M2型巨噬细胞的比例显著增加。因此，TAMs在TME所有肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocytes,TILs)中所占的比例(即TAMs/TILs)，特别是M2型TAMs所占的比例，是骨肉瘤预后不良的因素。Yang等[66]采用CIBERSORT软件对基因表达数据库(GeneExpressionOmnibus,GEO)中有关转移性骨肉瘤的数据进行挖掘分析后发现，单核细胞、活化的自然杀伤细胞、静止的记忆T细胞与骨肉瘤患者的生存时间呈正相关，而静止的树突状细胞、M2型巨噬细胞和原始CD4+T细胞与骨肉瘤患者的生存时间呈负相关，提示TME中淋巴细胞的构成和抗肿瘤免疫与患者的预后密切相关。此外，一项多中心研究也显示，治疗前TME中CD8+/FOXP3+≥3.08的骨肉瘤患者较CD8+/FOXP3+3.08的患者生存时间更长[67]。由于骨肉瘤肿瘤微环境构成成分对骨肉瘤来说具有一定特异性，因此可视为是一种相对特异性的预后预测指标。
(七)影像学指标
目前，文献报道中可用于骨肉瘤病情和预后评估的影像学检查手段主要有18F-氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(18F-fluorodeoxyglugosepositronemissiontomographywith