介绍
自然杀伤(NK)细胞可以在没有预先刺激的情况下杀死癌细胞，并且是用于癌症细胞治疗的有前途的工具(1,2)。鉴于NK细胞仅占外周血单核细胞(PBMC)的一小部分，因此获得足够数量的NK细胞以满足临床需求，尤其是在计划多次输注时，具有挑战性。基于NK细胞的疗法将极大地受益于产生大量高细胞*性NK细胞的可靠方法。
据报道，NK细胞可以在被细胞因子（例如白细胞介素(IL)-2）以及来自K和HFWT（Wilms肿瘤衍生细胞）等细胞系的蛋白质与NK细胞受体（例如NKG2D和NKp46等(3-5)。淋巴细胞、单核细胞、脐带间充质细胞、Epstein-Barr病*转化的淋巴母细胞、HFWT细胞、RPMI细胞和K细胞已被用作饲养细胞，用于从PBMC扩增NK细胞(6)。其中，K人白血病细胞最常用作NK细胞扩增的饲养细胞(5-7)。
最近，使用辐照基因工程K细胞（例如具有膜结合IL-21(mbIL21)和K细胞系的基于K的人工抗原呈递细胞）的方案报道了显着的高细胞*性NK细胞扩增率修饰以表达本研究中使用的膜结合IL-15(mbIL15)和4-1BB配体(K-mb15-41BBL)(7-9)。
小鼠胚胎饲养细胞通常用于长期培养程序和胚胎干细胞的集落再生，并且通常被辐射和丝裂霉素灭活(10)。与这些小鼠胚胎饲养细胞一样，饲养细胞应使用丝裂霉素C进行辐照或有丝分裂灭活，以避免K细胞过度生长并确保没有活的K细胞与扩增的NK细胞一起注入(11)。
虽然辐照是更安全、更有效的方法，但有些研究所没有辐照器。此外，每次需要时对饲养细胞进行辐照是一个费力的过程。如果冷冻保存的辐照饲养细胞在合理的时间段内保持高水平的活力，则该过程将更容易且耗时更少(10)。然而，对于转基因饲养细胞K-mb15-41BBL饲养细胞的冷冻保存知之甚少，尤其是在γ辐射后。在本研究中，我们比较了冷冻辐照和新鲜辐照的K-mb15-41BBL细胞作为NK细胞扩增饲养细胞的能力。
试验结果
4-1BB配体和膜结合IL-15在新鲜和冷冻保存的K-mb15-41BB饲养细胞上的表达。4-1BB配体和膜结合IL-15在受照射的K-mb15-41BB细胞上的细胞表面表达通过流式细胞术检查并在新鲜和解冻冷冻保存的细胞之间进行比较。新鲜和冷冻保存的K-mb15-41BB细胞具有相似的4-1BB表达水平；标记的新鲜细胞的平均荧光强度（MFI）为.4±71.7，标记的冻存细胞的平均荧光强度（MFI）为.7±2.8（p0.05；图1A和B）。膜结合IL-15在冻融细胞(MFI=36.6±2.3)上的表达略低于新鲜细胞(MFI=57.2±17.4,p0.05;图1C和D)。
NK细胞扩增率和纯度。使用两个饲养细胞组，我们比较了来自7个健康供体的PBMC的NK细胞的纯度和扩增率。在第14天（94.1±2.4对92.5±2.3%，p=0.）和第21天（97.1±1.9对95.4±2.6%，p=0.；图2A)。两个组的NK细胞在三周内迅速增殖，新鲜组和冷冻组之间的NK细胞扩增率没有显着差异（图2B）。
扩增的NK细胞对各种癌细胞系的细胞*性。我们检查了来自三个健康供体的扩增NK细胞对不同癌细胞系（如K、RPMI-、Raji、HL-60、SH-SY5Y、IMR-32、MG-63、Saos-2、和ES8。在4:1、2:1或1:1的E:T比率下，在新鲜和冷冻保存的饲养细胞组之间没有观察到细胞*性的显着差异（p0.05；图3）。
扩增的NK细胞上受体的表达。通过流式细胞术研究了NK细胞标志物CD16、NKG2D、CD69、NKp30、NKp44、NKp46和CDb在第14天从新鲜和冷冻保存组获得的扩增NK细胞上的表达。尽管供体之间存在轻微差异，但就表达特定受体的细胞百分比和分析的每种受体的相对表达而言，两组之间NK细胞标记物的表达相似（图4）。
图2体外扩增的人类自然杀伤(NK)细胞与新鲜K-mb15-41BBL饲养细胞和冷冻保存的K-mb15-41BBL饲养细胞共培养的纯度和倍数扩增。A：NK细胞的平均倍数扩增。新鲜组与冷冻保存组NK细胞的倍数扩增率没有显着差异(p0.05)B：扩增NK细胞的纯度通过流式细胞术测定，使用荧光素异硫氰酸酯偶联抗体抗人CD3和藻红蛋白-CY5偶联的人CD56抗体。新鲜组与冷冻保存组的平均NK细胞纯度在第0天和第7天没有显着差异，但在第14天和第21天（p=0.）。
扩增的NK细胞产生IFN-γ。评估了来自三个健康供体的扩增NK细胞响应K细胞而分泌的IFN-γ量。用新鲜饲养细胞获得的NK细胞与用冷冻保存的饲养细胞获得的NK细胞之间的IFN-γ水平没有显着差异（分别为.5±91.4与.1±85.2pg/ml；p0.05；图5）。
新鲜和冷冻保存的辐照K-mb15-41BBL饲养细胞的存活率及其在扩增NK细胞中的频率。为了研究辐射对两组饲养细胞的生物学效应，将新鲜和冷冻保存的辐照K-mb15-41BBL细胞在不含PBMC的完全RPMI-培养基中培养10天。通过流式细胞术鉴定了第0、3、7和10天的活性异硫氰酸荧光素(FITC)阳性Kmb15-41BBL细胞。如图6A和6C所示，新鲜辐照和冷冻保存辐照的细胞均未增殖，在培养的第7天分别仅5.18±0.12%和5.33±0.67%存活。在完全RPMI-培养基中，新鲜和冷冻保存的辐照饲养细胞的存活率没有显着差异。
比较两组受照射饲养细胞的存活率及其在NK细胞扩增过程中的频率。在新鲜和冷冻保存组之间的NK细胞扩增期间，在培养第0、3、7和10天，FITC阳性饲养细胞的频率没有观察到显着差异（图6B）。此外，新鲜组中只有4.76±4.05%、1.11±1.92%的FITC阳性饲养细胞和冷冻保存组中分别只有4.10±2.76%和0%在培养的第3天和第7天存活（图6D）。
为了确定扩增NK细胞是否可以杀死K-mb15-41BBL饲养细胞，将两种扩增NK细胞组中辐照饲养细胞的存活率与完全RPMI-培养基中辐照饲养细胞的存活率进行比较。扩增的NK细胞中FITC阳性饲养细胞的存活率显着低于完全RPMI-培养基组（培养第3天时为3.0±3.2%对80.4±3.5%，p=0.；0.6±1.4%对分别为5.3±0.4%，在培养第7天，p=0.）。
讨论
检查了冷冻保存对K细胞上基因工程分子表达的影响。4-1BBL在K-mb15-41BBL细胞上的表面表达未因冷冻保存而改变，而与新鲜细胞相比，在冷冻保存的K-mb15-41BBL饲养细胞上膜结合IL-15的表达略低。然而，在冷冻保存和新鲜照射的饲养细胞之间没有观察到统计学上的显着差异，这表明饲养细胞中基因工程分子的表达不受冷冻保存的严重影响。
比较了冷冻保存和新鲜照射的K-mb15-41BBL细胞作为NK细胞扩增饲养细胞的能力。尽管在第14天和第21天，新鲜饲养细胞扩增NK细胞的纯度略高于冷冻保存细胞，但新鲜和冷冻保存组在NK细胞扩增率、对各种恶性细胞系的细胞*性、NK细胞受体（CD16、NKG2D、CD69、NKp30、NKp44、NKp46和CDb）的表达和IFN-γ分泌水平。
图3使用新鲜K-mb15-41BBL饲养细胞和冷冻保存的K-mb15-41BBL饲养细胞扩增的自然杀伤(NK)细胞的细胞*性。扩增的NK细胞对K的细胞*性(A)RPMI-,(B)ES8,(C)RAJI,(D)HL-60,(E)SH-SY5Y,(F)IMR-32,(G)MG-63、(H)Saos-2和(I)ES8细胞系使用基于流式细胞术的方法以4:1、2:1和1:1的效应细胞：靶标比率进行测量。显示的结果是来自三个供体的样品的平均值±SD。
图4使用新鲜K-mb15-41BBL饲养细胞和冷冻保存的K-mb15-41BBL饲养细胞扩增自然杀伤(NK)细胞表面受体的表达。针对人CD16(A)、自然杀伤组2、KG2D(B)、CD69(C)、NKp30(D)、NKp44(E)、NKp46(F)和CDb(G)抗体用于在第14天分析NK细胞受体。
在本研究中，对恶性尤文肉瘤细胞系和神经母细胞瘤细胞系的细胞*性相当高；然而，骨肉瘤细胞系不太敏感，如图3所示。目前的发现似乎与之前的报告一致(11)。在E:T比例为4:1、2:1或1:1的所有测试细胞系中，新鲜组和冷冻保存组之间的细胞*性未发现显着差异。
在本研究中，K-mb15-41BBL细胞被冷冻保存在90%FBS中，10%DMSO作为冷冻保护剂。
有两种传统的慢速冷冻方法：控制速度冷冻(CRF)，它使用速度控制的冷冻机，以及不控制速度冷冻(URF)，它使用被动冷却装置，例如填充有异丙醇的小型低温容器。在本研究中，使用更简单、省时且成本较低的URF方法来冷冻保存K-mb15-41BBL细胞。
图5扩增的NK细胞响应K白血病细胞分泌的干扰素(IFN)-γ水平。在24h时收集无细胞培养上清液，并通过ELISA分析IFN-γ含量。
图6新鲜和冷冻保存的辐射K-mb15-41BBL饲养细胞的存活率及其在扩增的自然杀伤(NK)细胞中的频率。A和C：通过流式细胞术分析K-mb15-41BBL细胞的存活率。新鲜和冷冻保存的辐照饲养细胞在培养后没有增殖。B：扩增NK细胞中的K-mb15-41BBL细胞门控是通过单独对K-mb15-41BBL异硫氰酸荧光素(FITC)阳性细胞进行门控来建立的。实验是使用新鲜的K-mb15-41BBL和冷冻保存的K-mb15-41BBL饲养细胞在NK细胞培养的第0、3、7和10天进行K-mb15-41BBL细胞门控。在扩增的NK细胞组之间，FITC阳性饲养细胞的频率没有观察到显着差异。D：比较两个扩增的NK细胞组中FITC阳性饲养细胞的存活率。不到5%的FITC阳性饲养细胞在NK细胞扩增的第3天存活。实验是在来自三个供体的细胞上进行的，所有样品都一式三份进行测试。显示了代表性结果。
含有K-mb15-41BBL饲养细胞的冷冻管在液氮罐中冷冻保存长达四个月。就扩增的NK细胞的数量和功能而言，新鲜和冷冻保存的细胞之间没有发现差异。可能需要进一步调查以确定较长时间（例如一年）的K-mb15-41BBL饲养细胞冷冻保存是否会影响来自人PBMC的NK细胞的扩增。
小鼠胚胎饲养细胞通常用于胚胎干细胞的长期培养程序和集落再生，并且通常被辐射和丝裂霉素灭活(10)。与这些小鼠胚胎饲养细胞类似，饲养细胞应使用丝裂霉素C进行辐照或有丝分裂灭活，以避免K细胞过度生长并确保没有活的K细胞与扩增的NK细胞一起注入(11)。为避免饲养细胞过度生长，它们以30-Gy(5,23-25)的不同剂量进行辐照，这被认为是安全有效的。与使用Gy辐照K饲养细胞的其他报告类似(7)，在本研究中，Gy辐射用于饲养细胞处理。比较辐照对两组K-mb15-41BBL饲养细胞的生物学效应。正如预期的那样，新鲜和冷冻保存的辐照细胞都没有增殖，在培养的第7天分别只有5.18±0.12%和5.33±0.67%存活。
为了研究扩增NK细胞是否可以杀死K-mb15-41BBL细胞，比较了NK细胞扩增过程中细胞与仅维持在完全培养基中的细胞之间受照射饲养细胞的存活率。在第3天培养时，FITC阳性K-mb15-41BBL饲养细胞在扩增NK细胞中的存活率显着低于完全RPMI-培养基中的饲养细胞（分别为3.0±3.2%和80.4±3.5%；p=0.）。正如预期的那样，扩增NK细胞本身会杀死受辐射的K-mb15-41BBL细胞，因为K是对NK细胞最敏感的细胞系。
Lapteva等人设定的临床级NK细胞产品的放行标准(26)是NK产品中FITC阳性细胞的0.1%频率。他们报告说，在培养的第10天，NK产品中FITC阳性细胞的频率为0.01-0.07%。在我们的研究中，在培养的第10天，新鲜组(n=3)和冷冻保存组(n=3)扩增NK细胞中GFP阳性细胞的频率均为0%，这一发现满足了释放标准0.1%。这些结果在意料之中，因为转基因K-mb15-41BBL细胞接受了Gy的辐射，并且非常容易被培养中增殖的NK细胞杀死。此外，这些结果是预料之中的，因为没有使用K-mb15-41BBL细胞进行每周重复刺激，并且因为我们的协议使用了非常低的辐射K-mb15-41BBL细胞与PBMC的比率(0.08:1)，与其他协议；-Gy照射的K-mb15-41BBL细胞以K-mb15-41BBL与NK细胞(26)的10:1比例接种，以及Gy照射的基于K的基因工程人工抗原呈递细胞与mbIL21共同-与PBMC以2:1的比例培养(7)。
尽管辐照是比丝裂霉素C治疗更安全、更有效的方法，但某些研究所没有辐照器，并且机器通常位于良好生产规范(GMP)设施之外，尽管研究所可能有辐照器。在这种情况下，在多个小瓶中使用冷冻保存的辐照饲养细胞比每次需要时辐照细胞更方便。此外，它还有助于控制GMP设施中的感染。
在本研究中，我们表明，与新鲜辐照的饲养细胞相比，冷冻保存的辐照饲养细胞在1到4个月内保持了相似的功能。我们的结果表明，冷冻保存的辐照饲养细胞可用于人类NK细胞的离体扩增，为现有方法提供了便利的改进，尤其是在没有γ辐照器的情况下。
ATMP放行质量控制ATMP(AdvancedTherapyMedicinalProducts)，是指基于细胞、基因或组织工程学的疗法。由于该类药物生产过程中需要确保其生物活性，且效期非常短，其质量控制也面临独特挑战，需要结合独特的生物学方法和标准的理化方法来进行，并且需要对每一个步骤和细节进行严格的质量把控，避免污染。ATMP的微生物检测包括对细菌、真菌、支原体的污染鉴定。传统的微生物检测方法中，细菌及真菌的检测需要14天，支原体检测需要28天（图1），而许多ATMP的有效期仅有2天。快速、有效且安全的检测方法迫在眉睫。图1.无菌测试时间节点据此，《美国药典》(UPS)微生物替代方法验证，《欧洲药典》（EP5.1.6）微生物学质量控制的替代方法，以及《中国药典》(ChP)药品微生物检验替代方法验证指导原则中都对药品微生物检测做出相应补充，并推荐核酸扩增（NAT）作为药品微生物检验替代方法之一。“与传统方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能。同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。“——ChP基于核酸扩增法（NAT）的支原体检测目前风头最盛的ATMP要属CAR-T细胞治疗药物。年6月23日，中国首个CAR-T细胞药品奕凯达?获批上市，开启了中国肿瘤细胞治疗新篇章。在其中支原体检测步骤中使用到了赛多利斯Microsart?系列试剂盒。支原体是世界上最小的能够独立繁殖的原核微生物之一，显微镜下难以观察到是否发生支原体污染。基于qPCR的支原体检测，克服了传统技术在检测周期长和检测样品类型受限制等方面的问题。表1.药典支原体检测方法对比Microsart?ATMP支原体检测试剂盒基于NAT（例如qPCR）技术，3小时内即可精确、灵敏的检测支原体DNA，并且对EP2.6.7和EP2.6.21中罗列的所有支原体种类的最低检出限，以及培养基和背景细胞（如chondrocytes）的特异性和耐用性进行了有效验证。独特优势：赛多利斯推出Microsart?微生物快速检测系列试剂盒，仅需3小时即可完成药品放行所要求的细菌、真菌及支原体检测，降低患者用药安全隐患。本期讲座，赛多利斯微检产品专家马福成将在线分享药品微生物质量控制现状，以及基于qPCR技术的无菌快速检测方法。欢迎大家的参加！报名方式直播间已开放报名，快快扫码或点击文末“阅读原文”报名获取地址！
嘉宾介绍及大纲马福成赛多利斯微生物检测产品专家
厦门大学微生物学硕士，从事多年微生物检测相关工作，熟悉水中细菌及病*的检测方法及法规。现负责赛多利斯支原体快速检测、无菌放行快速检测、微生物限度检测、无菌检测及空气微生物监测等产品的技术支持工作。
课程主题及摘要：主题：前沿治疗药物（ATMP）微生物质量控制
摘要：
药品微生物质量控制的现状
qPCR技术的特点和优势
基于qPCR技术的无菌快速检测
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