异柠檬酸脱氢酶（IDH）在多种肿瘤中都有很高的突变频率，尤其胶质瘤，是唯一一种IDH1-RH（精氨酸突变为组氨酸）突变率极高的肿瘤类型，且这种突变类型有显著的临床预后意义。本文使用六个起源于四种肿瘤类型的大型独立DNA甲基化数据集的数据，研究不同类型IDH1/2突变的分子效应并证明其临床相关性。一起来学习一下这篇纯生信文章吧~
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小编rj
01摘要数据集：
COSMIC数据库筛选热点突变（IDH1R和IDH2R,R）;
随机III期CATNON临床试验，先前已有报道；
TCGA下载的LGG（DNA甲基化和RNA序列）、MSK-IMPACT（MemorialSloanKettering-integratedmutationprofilingofactionablecancertargets）、AML数据；
软骨肉瘤的临床和突变数据，先前已有报道；
TAVAREC试验，来源于文献
CGGA数据库
统计方法：
Kaplan–Meier方法绘制生存曲线，对数秩检验确定生存差异，对β值（甲基化探针强度/甲基化和非甲基化探针强度之和）进行Wilcoxon秩检验以确定差异甲基化探针，对M值（甲基化/非甲基化探针强度log2比率）进行F检验以识别差异甲基化CpG（胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤）
所有差异甲基化分析中的p值都以矫正后的p值代替（FDR值）
卡方检验确定突变频率的差异，IPA软件用于通路分析，cox回归建模并纳入临床性状，p0.05认为有显著意义
02流程图03结果简述IDH1-RH突变在胶质瘤中占主导地位首先在COSMIC数据库中筛选体细胞突变并提取热点突变((IDH1-R,IDH2-RandIDH2-R),然后按照肿瘤器官部位分层。IDH1/2突变频率高的肿瘤包括中枢神经系统（CNS）、胆道、骨、造血和淋巴肿瘤（白血病），且其（热点）突变分布存在显著差异。例如IDH1-RH突变是CNS肿瘤中最主要的IDH1/2突变（n=/，90.5%），而这种突变在骨骼（n=49/，13.6%）、白血病（n=/，17.3%）和其他肿瘤（n=14/，10.9%）中出现的频率要低得多，迄今为止还没有在胆道肿瘤中发现（n=）（p0.，卡方检验）。相比之下，IDH1-RC的突变在胶质瘤中非常罕见（/，2.8%），但在所有其他肿瘤类型中更为普遍：骨（n=/，67.1%），白血病（n=/，16.5%）、胆道（n=/，53.8%）和其他肿瘤（n=14/，10.9%）。还有一些其它差异如下图。IDH1-RH突变胶质瘤中DNA甲基化更低
其次使用来自CATNON试验样本的全基因组DNA甲基化数据，并比较IDH1-RH突变肿瘤（n=）与其它热点突变肿瘤（n=69）的基因图谱。结果显示，IDH1-RH突变的肿瘤的DNA甲基化总体水平显著降低，有个探针显示β值（有忘记β值的小伙伴前边有解释哦，它代表了甲基化水平）降低0.2（p0.01）但是没有探针显示出大于0.2的增加，火山图也证明了这一点。
在成人胶质瘤中，较高的DNA甲基化水平与更久的生存期有关。由于非RHIDH1/2突变的胶质瘤有更高的DNA甲基化水平，因此比较了不同IDH突变患者的总生存率。在CATNON随机III期临床试验中，与具有RHIDH1/2突变的患者相比，非RHIDH1/2突变肿瘤的患者的总生存率确实更高（如下图）。
下面这张热图有点意思，非RHIDH1/2突变的肿瘤聚集在该图的高甲基化端，尽管CATNON患者的临床随访有限，但死亡事件（event）的数量也更倾向于聚集在热图的去甲基化端，这表明这个探针的甲基化水平与生存率之间有很强的相关性，同时与前人研究提出的分型也有一致性。
接下来为了确定突变是否是独立于DNA甲基化亚型的预后因素，无论采用何种分型，非RHIDH1/2突变肿瘤患者的生存期明显长于IDH1-RH突变肿瘤患者。在多变量分析中，包括了试验中与生存相关的所有已知因素（治疗、年龄、皮质类固醇使用和性别），IDH1/2突变类型也是一个独立的预后因素。将DNA甲基化亚类纳入该分析中时，其仍具有显著性。这些结果表明IDH1/2突变类型是与患者生存相关的独立因素。
为了进一步证实上述结论，在TCGA胶质瘤数据集中进行验证，得到了与CATNON数据集类似的结果，在非RHIDH1/2突变的肿瘤中，DNA甲基化水平显著高于IDH1-RH突变的肿瘤，同时非RHIDH1/2突变肿瘤的患者存活时间也显著延长。
DNA甲基化通常与基因表达呈负相关，尤其是当甲基化的CpG位于转录起始点附近时。因此接下来分析得出在星形细胞瘤中，IDH突变差异表达基因（表达两倍，p0.01）中，大多数（/，86%）在IDH1-RH突变中上调（上图d）。这个基因的通路分析表明，IDH1-RH突变肿瘤中上调的基因参与了细胞运动、细胞死亡和存活、细胞间信号和相互作用以及碳水化合物代谢等过程。
随后用随机II期TAVAREC临床试验中包含的1p/19q非共缺失样本进行二次验证。在甲基化水平，CATNON和TAVAREC得到的结论重叠性很大，但是在TAVAREC中，IDH1-RH和非RH-IDH1/2突变肿瘤的患者之间的生存率并没有显著差异，这可能与试验的特定纳入标准有关：仅当肿瘤在进展期出现恶性进展迹象（MRI扫描对比增强）时才纳入患者。此外，CATNON、TCGA和TAVAREC联合生存数据的森林图显示，非RHIDH1/2突变肿瘤的估计HR为0.56，95%可信区间[0.37,0.85]，相关性p=0.。
最后为了检验突变依赖的DNA甲基化差异是否仅限于1p/19q非共缺失胶质瘤（星形细胞瘤），对（i）IDH1/2突变、1p/19q共缺失胶质瘤（少突胶质细胞瘤，TCGA），（ii）急性髓系白血病（TCGA）和（iii）软骨肉瘤的全基因组甲基化谱进行分析。尽管样本量较小，但仍然得出：与非RHIDH1/2突变肿瘤相比，IDH1-RH突变中的DNA甲基化更少。这些数据表明，在预测的D-2HG（D-2羟戊二酸，在IDH1-RH中低产生）低产生的IDH1/2突变的肿瘤中，DNA甲基化水平更低。
TCGA数据集1p/19q共缺失胶质瘤确定了个差异表达基因，与在星形细胞瘤中观察到的相似，大多数基因（/，83%）在IDH1-RH突变肿瘤中上调。此外，这两个差异分析之间有相当程度的一致性，有16个基因共同鉴别出来。
由于包含1p/19q共缺失胶质瘤的样本和事件数量太少，无法在TCGA、MSK-Impact和CGGA中确定生存差异（图e，f）。
04小结与其他肿瘤相比，胶质瘤的IDH1/2突变有更加特殊的意义，它们具有尤其高比例的IDH1-RH突变，并有显著临床相关性。据推测，IDH1-RH突变在D-2HG（D-2羟戊二酸）产生能力相对较差，本文研究数据与观察结果一致，即D-2HG水平较高的胶质瘤患者预后较好，非RHIDH1/2突变的胶质瘤患者存活时间更长，并且与DNA甲基化和基因表达有强相关性，这预示了对临床实践的重要意义，在未来的临床试验中可作为分层因素考虑。
这项研究也有其局限性，比如一些数据集的样本量相对较小，尤其是那些非1p/19q共缺失胶质瘤的数据集。此外，缺乏D-2HG水平数据限制了对IDH1/2突变类型与全基因组DNA甲基化直接相关性的探索。
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