年11月6日/医麦客新闻eMedClubNews/--人类自然杀伤细胞(NK)占所有循环淋巴细胞的15%。NK细胞发现于20世纪70年代，主要与杀死感染的微生物和恶性转化的同种异体和自体细胞有关。NK细胞表现出抗肿瘤细胞*性，无需事先致敏和产生细胞因子以及调节各种免疫反应的趋化因子。
NK细胞是先天性淋巴细胞，具有细胞*性效应，参与启动适应性免疫应答。一旦被激活，NK细胞分泌促炎细胞因子，并触发穿孔素/颗粒酶诱导的靶细胞裂解。它们能够精准地攻击和清除不正常的细胞，同时可调节机体的免疫状态和免疫功能，表明NK细胞具有作为“抗癌卫士”的潜力。▲NK细胞介导的肿瘤细胞*性机制嵌合抗原受体（CAR）是一种受体蛋白，它赋予免疫细胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。它的细胞外抗原结合域通常为单链抗体（scFv），可以识别肿瘤细胞表面的特异性抗原。近年来，嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)在血液肿瘤治疗中的应用取得了成功，并成为肿瘤免疫治疗的临床热点。然而，它们的广泛应用受到固有风险的限制，如移植物抗宿主病(GvHD)和长期感染限制CAR-T细胞的产生等。除此之外，大多数CAR-T细胞疗法研究都使用自体T细胞，主要是为了规避自体细胞识别异体T细胞引发的GVHD（移植物抗宿主病）风险。但有研究表明，在众多血液肿瘤和实体恶性肿瘤患者中注入单一来源的脐带血NK细胞不会引起GVHD。NK细胞的安全性及其抗肿瘤潜力，使它们成为实施CAR技术的有希望的细胞类型，可将其细胞*性潜力重定向至特定靶标。这使CAR-NK细胞疗法具有成为普遍性产品的潜力。这些产品可能比CAR-T细胞疗法更安全。目前，CAR-NK细胞的免疫疗法研究成为越来越多研究者的选择方向。推荐阅读：两家韩国公司合并：拥有默沙东青睐的CAR-NK和上市15年的T细胞产品丨医麦猛爆料
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CAR-NK产品的潜在优势
截止目前，已经有5款CAR-T产品获得美国FDA批准上市，用于治疗血液癌症。年6月，中国也迎来了首款获批的CAR-T产品。不过，CAR-T产品在临床应用中存在着生产周期长、有细胞因子风暴及神经*性副作用等挑战，限制了它们的广泛应用。此外，CAR-T产品在实体瘤领域尚未取得突破。而基于NK细胞开发的CAR-NK产品被认为有潜力解决上述挑战。
▲CAR-NK细胞的产生过程（图片来源：参考资料1）根据《柳叶刀》子刊EBioMedicine上发表的一篇综述，CAR-NK细胞治疗产品具有以下几个潜在优势：
更好的安全性
首先，CAR-NK细胞免疫疗法比CAR-T细胞免疫疗法具有更好的安全性。CAR-T细胞免疫治疗的主要副作用之一是由于CAR-T细胞的持续存在而产生的靶向效应。相反，CAR-NK细胞的寿命很短，几乎不会产生靶向效应。
其次，同种异体NK细胞输注耐受性良好，不会引起GVHD和明显的*性。因此，NK细胞是一种适应性更强的CAR载体，而不仅仅局限于自体细胞。
此外，CAR-NK产品还有望降低CAR-T治疗中出现的细胞因子释放综合征(CRS)和神经*性副作用，这是因为NK细胞产生的细胞因子种类与T淋巴细胞产生的细胞因子种类有很大不同。CAR-T细胞通常是通过分泌促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6诱导细胞因子风暴。而活化的NK细胞则是产生IFN-γ和粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。
仍具有天然的抗肿瘤细胞的*性
第二，CAR-NK细胞仍具有天然的抗肿瘤细胞的*性，除了通过单链抗体识别肿瘤表面抗原来抑制癌细胞外，NK细胞还可以通过多种受体识别各种配体来抑制癌细胞，例如自然细胞*性受体（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM-1（CD）。这些NK细胞受体通常识别在免疫细胞或长期治疗压力下肿瘤细胞上表达的应激诱导配体。
此外，NK细胞可通过CD16介导的ADCC机制清除肿瘤细胞。因此，CAR-NK细胞可以通过CAR依赖和NK细胞受体依赖的多种作用机制，有效地清除肿瘤抗原阳性癌细胞或表达NK细胞受体配体的癌细胞。临床试验表明，CAR-T细胞不能消除高度异质性的癌细胞，但是CAR-NK细胞能够有效地杀死长期治疗后可能改变其表型的残留肿瘤细胞。
具有成为“通用型”产品的潜力
第三，CAR-NK疗法具有成为“通用型”产品的潜力。由于NK细胞在临床样本中非常丰富，可以从外周血（PB）、脐带血（UCB）、人类胚胎干细胞（HESC）、诱导多能干细胞（IPSC）甚至NK-92细胞系中产生，再加上同种异体NK细胞安全性更好，因此CAR-NK细胞有望提供一种“通用型”产品，解决困扰目前CAR-T产品的生产周期长和个体化需求的难题。
CAR-NK细胞疗法的研究现状
基于CAR-T的策略设计开发的CAR-NK产品，通过设计针对不同肿瘤的靶点使NK细胞特异性的杀伤肿瘤细胞，针对血液瘤和实体瘤设计了不同的CAR-NK细胞产品，针对不同的血液瘤开发了如NK92-CD19-CD3ζ针对B系恶性肿瘤、CD-CAR-NK-92针对多发性骨髓瘤等。
▲CAR-NK细胞在血液瘤中的临床前研究
此外，对不同的实体瘤也开发了不同的CAR-NK产品，如EGFR-CD28-CD3ζ针对成胶质细胞瘤、NKG2D-DAP10-CD3ζ针对骨肉瘤、肝细胞癌(HCC)、胰腺癌和乳腺癌等，这些经过不同修饰的CAR-NK细胞在抗肿瘤中都表现了较好的效果。
▲CAR-NK细胞在实体瘤中的临床前研究
根据ClinicalTrials.gov网站公示信息，目前已有许多CAR-NK产品的临床试验正在开展中，大部分处于1/2期临床试验阶段。从靶点来看，与CAR-T类似，多数CAR-NK细胞治疗产品靶向的是常见的恶性血液癌症靶点，如CD19、CD22、BCMA、CD33等。还有一些CAR-NK产品靶向的是实体肿瘤相关抗原，如PSMA、间皮素、ROBO1、NKG2D等。CAR-NK产品的潜在优势已在临床前研究和一些临床研究中得到了初步验证。年《新英格兰医学杂志》（NEJM)上发表的一项研究显示，11名癌症患者接受了一种靶向CD19的CAR-NK产品治疗，7名患者出现了完全缓解（CR），且都没有出现CAR-T产品治疗中常见的细胞因子释放综合征（CRS）、神经*性等*副作用。《自然-医学》也将这一进展也列为了年度生物医学领域的十项瞩目进展之一。▲CAR-NK治疗实体瘤的部分临床试验CAR-NK疗法试图突破实体瘤挑战
CAR治疗的一个主要障碍是缺乏对实体瘤的疗效。这是由于肿瘤灌注不良、TAA异质性和实体瘤伴发的免疫抑制肿瘤微环境（TME）所致。▲肿瘤微环境(TME)中的NK细胞功能障碍（图片来源：参考资料1）
CAR-NK疗法试图解决这些问题，一些临床试验已经应用于实体恶性肿瘤的治疗。而最近的临床前和临床研究支持了这样一种观点，即CAR-NK细胞疗法可以在人类血液学和实体恶性肿瘤中发挥预期的效果，这意味着它们具有广泛的临床应用。这一观点强调了开发CAR-NK细胞疗法作为癌症免疫疗法背景下的一种创新策略，并简要概述了CAR-NK细胞疗法在人类恶性肿瘤中的最新发现，重点是临床前研究。EGF受体(EGFR)是一种众所周知的酪氨酸激酶受体，并且仍然处于肿瘤靶向治疗的前沿。此外，报告显示，EGFR特异性CAR-NK-92细胞和原代NK细胞在暴露于乳腺癌细胞系MDA-MB-、MDA-MB-后在体外表现出显着的细胞*性和IFN-γ产生和MCF-7，而EGFR特异性CAR-NK-92与原代NK细胞相比显示出更好的治疗效果。在乳腺肿瘤的异种移植模型中，肿瘤内注射EGFR-CAR-NK-92细胞或溶瘤单纯疱疹病*1(oHSV-1)可阻止肿瘤发展，同时与EGFR-CAR-NK-92联合治疗细胞和oHSV-1，导致更明显的肿瘤细胞消除和移植小鼠的存活时间延长。此外，EGFR-CAR-NK-92细胞给药导致乳腺癌细胞系衍生异种移植物(CLDX)和患者衍生异种移植物(PDX)小鼠模型中三阴性乳腺癌(TNBC)的消退。同样，在原位胶质母细胞瘤(GB)异种移植小鼠模型中，颅内注射EGFR-CAR-NK-92细胞有力地抑制了肿瘤的发展，从而延长了荷瘤小鼠的总体存活率，将重定向的NK细胞引入了一种有效的治疗策略。其他研究表明，用趋化因子受体CXCR4对这些EGFR-CAR-NK细胞进行进一步的基因修饰，可以在体外提高对基质细胞衍生因子1（SDF1）产生U87-MG胶质母细胞瘤细胞的趋化性，并促进异种移植小鼠的存活与EGFR-CAR-NK细胞治疗相比。相反，在90%的卵巢癌中过表达的叶酸受体α(αFR)的特异性靶向，通过使用αFR特异性CAR-NK-92细胞导致αFR+肿瘤细胞在体外和小鼠异种移植物中的选择性裂解卵巢癌模型。此外，比较分析表明，第三代αFR-CAR-NK-92细胞在对αFR+肿瘤细胞的有效细胞*性方面优于第一代和第二代CAR。此外，间皮素特异性CAR-NK细胞可以选择性地消除间皮素阳性卵巢癌细胞（OVCAR-3和SK-OV-3），而它们在体外对间皮素阴性细胞（SK-HEP-1）无反应。更重要的是，重定向的NK细胞在皮下和腹膜内肿瘤模型中均能有效根除卵巢癌细胞，这表明除αFR外，间皮素可能是卵巢癌靶向治疗的可行靶点。
最近，其他研究结果表明，趋化因子受体CXCR1和CAR的共表达可能提供一种创新策略，通过增强效应免疫细胞的肿瘤浸润来提高NK细胞在人类卵巢肿瘤中的治疗效果。例如，在异种移植模型中，施用经过基因修饰以表达CXCR1和靶向NKG2D配体的CAR的NK细胞在体内对肿瘤细胞具有更好的迁移能力。此外，CAR-NK细胞发挥的细胞*性不受CXCR1转基因表达的负面影响，并且所施用细胞的肿瘤运输改善导致异种移植物中的抗肿瘤反应增强。
与亲代NK细胞相比，神经节苷脂GD2特异性CAR-NK细胞对GD2+神经母细胞瘤(NB)细胞显着诱导更高的细胞*性。除了GD2-CAR-NK细胞显着转移到3D肿瘤球体中，导致生长速度降低，如活细胞成像分析所证明的那样，GD2-CAR-NK治疗抑制了小鼠的肿瘤发展。此外，进一步的分析表明，重新定向NK细胞和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)/程序性细胞死亡配体1(PD-L1)阻滞剂的联合治疗可能更有效地抗-癌症功能。
CAR-NK细胞目前被认为是肝细胞癌(HCC)治疗的可靠免疫治疗方式。因此，与GPC3+HCC细胞共培养的glypican-3(GPC3)特异性CAR-NK-92细胞引起显着的体外细胞*性和细胞因子释放，并且还在高和低表达GPC3的HCC异种移植物中刺激了体内抗肿瘤作用水平，但在没有GPC3表达的情况下则不然。相应地，在GPC3+HCC异种移植物中，消除肿瘤发展同时增强了肿瘤细胞凋亡。
关于TGF-β抑制NK细胞功能的能力，研究人员通过基因工程改造NK-92细胞以表达一种嵌合受体，其中TGF-βII型受体的胞外和跨膜结构域与NKG2D的胞内结构域相伴，称为TN嵌合受体。他们发现表达TN的NK-92细胞对TGF-β诱导的抑制性信号传导具有显着的抵抗力，并且还在体外刺激了更高的杀伤能力和对HCC细胞的IFN-γ生成。此外，表达TN的NK-92细胞显着转移到表达TGF-β的恶性肿瘤中，并在HCC异种移植鼠模型中抑制肿瘤进展，表明TN嵌合受体可用于提高NK的抗肿瘤功效细胞过继疗法。
小结
NK细胞具有独特的抗肿瘤效应，不受MHC限制的细胞*性、产生细胞因子和免疫记忆等功能，使其成为先天性和适应性免疫反应系统中的关键角色。
与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有自己独特的优点，但仍面临着一些挑战。这些挑战包括细胞增殖的改善，使细胞*性的激活更有效，以及最终找到NK细胞的最佳重建方法。相信解决好这些问题，基于NK细胞优秀的抗肿瘤血统，极有可能在CAR修饰的武装下为肿瘤治疗带来新的突破。相信，CAR-NK细胞疗法可能会导致肿瘤免疫治疗的革命性进展。
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