摘要
最近的证据表明，外泌体可以介导某些microRNAs(MiRNAs)，这些microRNAs参与了肿瘤发生和发展中的一系列生物学功能。我们以前的研究表明，microRNA-21(miR-21)在食管癌细胞及其相应的外泌体中都有丰富的表达。本研究探讨了外泌体穿梭miR-21在食管癌进展中的作用。我们发现外泌体可以从胞外空间内化到细胞质中。外泌体衍生的Cy3标记的miR-21模拟物可以中性鞘磷脂酶2(NSMase2)依赖的方式转运到受体细胞中。供体细胞过表达MIR-21通过靶向程序性细胞死亡4(PDCD4)并激活其下游的c-jun氨基末端激酶(JNK)信号通路，显著促进受体细胞的迁移和侵袭。我们的人群血浆样本分析表明，miR-21在食管癌患者的血浆中显著上调，并显示出与食管癌的显着风险相关。我们的数据表明，穿梭于外泌体的miR-21与食管癌复发和远处转移密切相关。因此，穿梭于外泌体的miR-21可能成为预测食管癌患者预后的潜在生物标志物。
介绍
食管鳞状细胞癌(ESCC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康(1)。由于目前的ESCC筛查方法都是侵袭性的，而且很难在早期发现ESCC，所以对ESCC进行具有临床意义的微创检测是必要的。最近，循环中的肿瘤细胞相关microRNAs的潜在应用已被研究，这些miRNAs已被认为是血浆或血清中用于癌症诊断的新的生物标志物(2-6)。对癌症患者血浆中miRNA的表达谱进行了一系列研究，以探索肿瘤特异性miRNA。对胰腺癌(PC)的研究发现，胰腺癌患者血浆中有37个miRNAs表达下调，54个miRNAs表达上调。此外，miR-21与较差的PC存活率相关，而let-7与存活率呈负相关(7)。随着下一代深度测序技术的发展，基于Illumina平台的测序技术被用于建立鼻咽癌患者血浆miRNA图谱，发现13个miRNA是鼻咽癌特异性的(8)。MiRNAs可能被广泛用作临床生物标志物，因为血浆中的miRNAs被证明对核糖核酸酶消化和温度变化具有抵抗力(9，10)。
据报道，外泌体是内源性的小囊泡，与从肿瘤细胞和健康细胞包裹的miRNAs一起释放，参与细胞间的通讯(11-13)。Rabinowits等人(14)评估了来自肺腺癌组织和循环外泌体的12个miRNAs与对照组的表达水平；他们的研究发现，肿瘤来源的miRNA模式与循环外泌体miRNAs相似。Taylor等人(15)在卵巢癌患者中检测到比良性卵巢疾病或对照组更多的循环上皮细胞粘附分子(EpCAM)阳性外泌体。他们还发现，卵巢癌细胞和外泌体之间存在相似水平的miRNA图谱，这表明肿瘤来源的外泌体miRNA图谱可以作为一种诊断方法。因此，外泌体的循环miRNA谱对肿瘤的早期诊断、预后和复发有重要的应用价值。
目前的研究表明，外泌体衍生的miRNAs转移到受体细胞是一种新的机制，除了经典的机制之外，这些机制包括细胞与细胞的直接接触或化学受体介导的事件(16)。近年来，涉及鉴定外泌体miRNA功能的研究越来越多。肿瘤细胞衍生的外泌体形成的miRNAs已被证实可以进入受体细胞并发挥其生物学功能。Nouraee等人(17)证明在食管癌细胞的条件培养液中可以检测到miR-21。此外，当食管癌细胞与成纤维细胞共培养时，观察到这些细胞miR-21表达显著上调，这一过程为外泌体穿梭miRNAs的转移提供了可能。一些研究人员发现，与miR-10b载体稳定转染的乳腺癌细胞的外泌体共培养可以诱导乳腺上皮细胞侵袭，因此，外泌体穿梭的miRNAs可能在肿瘤微环境调节中发挥重要作用[18]。白血病细胞与内皮细胞共培养的研究表明，外源性miR-92a通过靶基因整合素5α(19)，通过胞外转运促进受体内皮细胞的迁移和管状形成，如内源性miR-92a。越来越多的证据增加了遗传信息可以通过外泌体在细胞间转移的可能性。因此，我们假设外切的miRNAs可以在食管细胞之间转移。此外，某些miRNAs可能通过影响其在受体细胞中的靶基因而导致生物学特性的改变。
在我们以前的研究中，通过高通量测序(20)从食道癌细胞中获得了外泌体miRNAs的表达谱(20)；在此基础上，我们发现miR-21在食管癌细胞及其相应的外泌体中都有丰富的表达。然而，关于外泌体转运miR-21在食管癌中的功能研究尚未见报道。在本研究中，我们通过分析外泌体穿梭miR-21对食管癌迁移和侵袭的影响，探讨其在食管癌进展中的作用。此外，我们还研究了该基因背后的调控机制，包括靶基因和下游分子。还进行了病例对照研究，以确定外泌体穿梭miR-21与食道癌风险之间的关系。
实验程序
标本收集和伦理声明。研究对象医院收治的70例患者，年龄47~82岁，均征得其同意。所有患者均经病理或内镜检查证实为食管鳞癌，术前未行放疗或化疗。血浆样本采集自70名健康志愿者，年龄在46-84岁之间，年龄和性别与患者相匹配。在这些患者中，选择了三名年龄分别为58岁、73岁和77岁的ESCC女性患者和三名60岁、76岁和80岁的女性健康志愿者的血浆样本进行miRNA芯片分析。在招募之前，所有受试者都要获得书面同意。该研究方案由中国南京医院机构评审委员会(IRB)批准。食道癌研究的设计，包括血浆样本采集，得到了IRB的批准。
MiRNA微阵列。收集3对ESCC患者和健康对照者的血浆样本进行基因芯片分析。使用AgilentHumanmiRNA微阵列(v19.0；AgilentTechnologiesInc.，SantaClara，CA，USA)进行分析。对6例食管标本的miRNA样品进行标记，并与AgilentTechnologies的miRNA全标记杂交试剂盒(AgilentTechnologies)进行杂交。使用GeneSpring软件11.0(安捷伦技术公司)对信号进行归一化。用方差分析比较不同miRNA的表达。
细胞培养。人食管癌细胞系EC(中国医学科学院肿瘤研究所、北京协和医学院分子肿瘤学国家实验室)(21)在含10%胎牛血清(FBS)、U/ml青霉素和μg/ml链霉素的RPMI-培养基中培养。FBS离心00xg30min，然后xg超速离心6h，使用70型Ti转子在L-80xP超速离心机(BeckmanCoulter，Brea，CA，USA)(22)中去除牛源性外泌体。细胞培养在37?C，5%二氧化碳，水饱和的大气中进行。
外泌体纯化。培养48h后收集EC(1x细胞)的培养液，差速离心。简而言之，首先将培养基以xg离心10min，xg离心10min，xg离心20min，00xg离心30min，以去除任何活的或死亡的细胞和细胞碎片。然后，将上清液在×g下超速离心3h，制成外泌体颗粒。将上清液处理后，用×g磷酸盐缓冲液洗涤2h，在4?C下进行所有步骤，最后将小丸重新悬浮在合适的缓冲液中以供进一步研究。外泌体水平是通过测量外泌体中的总蛋白含量(以微克总蛋白表示)来确定的。用PIERSBCAProotEinasaykit(Therrmomihicient，Wilmiington，DE，USA)测定外泌体组分的蛋白质含量(Therrmomihicient，Wilmiington，DE，USA)。
外泌体标记和活细胞荧光显微镜。用RPMI-培养基，加入5μg/ml的DiII(Biotium，Hayward，CA，USA)，将外泌体颗粒悬浮液稀释到40μg/ml浓度，DiI是一种标记质膜的荧光染料。然后将该悬浮液在37?C孵育30分钟，然后通过0.22μM过滤器去除细菌。使用kDa的超滤管(PallCorp.，Washington，NY，USA)在×g的条件下离心10分钟，5次除去过量的染料。将2xEC和1.5ml全培养基(含10%胎牛血清的RPMI-)置于35mm玻璃底培养皿(NestBiotechnologyCo.，中国，无锡)中进行活细胞成像系统分析。培养24h后，将DiI标记的外泌体与细胞孵育2.5h，洗涤一次以清除游离的外泌体。然后细胞被转移到显微镜的细胞培养室，那里可以提供维持活细胞所需的温度和二氧化碳浓度。荧光发射用X60油浸物镜采集，通过EMnm发射滤光片。可以使用UltraVIEWVoxLiveCell成像系统(Perkin-Elmer，Waltham，MA，USA)以0.6ftp的速度记录荧光图像。
共育实验。EC细胞在12孔Transwell种植体(CAT)中共培养。编号；美国纽约州康宁市康宁公司)。将EC细胞作为受体细胞，以1×个/孔的密度预先接种在下腔中。第二天，将转染miR-21模拟物的EC细胞或作为供体细胞的阴性对照细胞刮下，接种到0.4μMTranswell插入物上，该插入物被过滤到上清液中，而不被过滤到细胞成分(23)中。
抑制外泌体释放。为了验证miR-21的分泌是否依赖于外泌体的转运，使用nSMase2的特异性化学抑制剂GW(sc-；SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA，USA)阻止外泌体的释放。EC细胞预先接种于24孔板中，在完全培养基中培养12h。培养结束后，将培养基换成不同浓度GW的新鲜完全培养基。收集细胞，孵育48h后，从培养液中提取外泌体组分。
Cy3标记的miR-21模拟物的转移效率测定。用脂质体RNAiMAx(Invitgen)将30nM的Cy3标记的miR-21模拟物转染EC细胞(3.5×个/孔)。转染12h后1d，处理培养液，用PBS洗涤细胞3次，去除残留的转染剂。随后，将培养基更换为新鲜的完全培养基。取供体细胞培养液，离心培养24h后去除残留细胞。然后将这些细胞加入预先接种的受体EC细胞中(2×个/孔)，放入6孔板中。在培养3、6、24h后获得受体细胞。流式细胞仪以荧光细胞百分率计算转染率。用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测受体细胞miR-21的表达水平。
RNA提取及定量逆转录聚合酶链反应。分别使用TRIzol试剂(Invitgen)和mirVanamiRNA分离试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)从细胞和外泌体中提取总RNA。使用NanoDrop分光光度计(NanoDropND-0；NanoDropTechnologies，Inc.，Wilmington，DE，USA)分析RNA浓度。RT-qPCR使用SYBR-GreenMasterMixPlus(丰田市，大阪，日本)进行。使用PrimerExpress软件版本3.0(美国加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司)在96孔板上进行实时PCR。在miR-21表达水平分析中，分别以RNU6和cel-miR-39作为细胞和培养上清液的不变对照。以β-肌动蛋白作为不变对照进行基因分析。PDCD4引物序列为正向5‘-TATGATGTGGAGGAGGTGGGATGTGA-3’和反向5‘-CCTTTCATCCAAAGGCAAACTACAC-3’。基质金属蛋白酶(MMP)-2引物序列依次为：正向5‘-CTGATGGCACCCATTACACCT-3’和反向5‘-GATCTGAGCGATGCCATCAAA-3’。MMP9引物序列为正向5‘-TGGGCTACGTGACCTATGACAT-3’和反向5‘-GCCCAGCCCACCTCCACTCCTC-3’。β-Actin引物序列为：正向5‘-ATCCGCAAAGACTGT-3’和反向5‘-GGGGTGTAACGCAACTAAG-3’。用于miR-21、RNU6和cel-miR-39扩增的引物购自广州RiboBio有限公司(中国广州)。聚合酶链反应在95?C下进行5min，然后在95?C下进行15秒，60?C下进行30秒，72?C进行30秒的40个循环。分析60~99?C的解离曲线，用ΔΔCt方法计算各miRNA的相对转录量。
细胞迁移试验。Transwell迁移分析使用Transwell插件进行，该插件包含孔径为8μM的聚碳酸酯过滤器(CAT)。号；康宁)。将转染的受体细胞(5×)悬浮在μl无血清RPMI-中，加入24孔上室。室被放置在24孔板中，并将含有10%胎牛血清的μlRPMI-添加到多孔插入组件的底孔中。细胞在37?C下孵育12h，以允许细胞在膜上迁移。迁移细胞用95%乙醇固定，结晶紫染色。用FSx(奥林巴斯)在倍的倍率下捕获迁移的细胞图像。通过在膜下表面的10个随机场计数来定量细胞迁移。
细胞侵袭试验。通过Matrigel(BDBiosciences)包被、孔径为8μM(CAT)的Transwell植入物检测共培养模型中供体细胞和受体细胞的侵袭性。号；康宁)。将大约μl无血清RPMI-中的细胞悬浮液(1x个细胞)以三重孔的形式加入到电离室的上孔中，而下孔则用含有50%胎牛血清的RPMI-填充到顶部(~μl)。孵育12h后，用棉签取出非侵袭性细胞，加入MTT原液，得到培养液中MTT的最终浓度为0.5mg/ml。然后，将贴壁细胞的嵌入物在37?C下孵育4h，然后加入μl%二甲基亚砜每孔溶解MTTFormazan产物。充分混合后，用微板阅读器在nm测试波长下测量吸光度。
荧光素酶报告试验。用PCR方法从人基因组DNA中扩增出含有miR-21结合位点的PDCD4mRNA的3‘-UTR片段。随后，将该片段克隆到编码两个荧光素酶报告基因的pmiR-Rb-Report质粒(广州RiboBio)中，得到野生型质粒pmiR-Report-WTPDCD4。突变型质粒pmiR-report-mut-PDCD4是通过将miR-21‘AUAAGCU’的结合位点从相应的野生型pmiR-RB-Report质粒改变为‘UAUUGCA’而产生的。用脂质体RNAiMAx将pmiR-Report-WT-PDCD4和相应的突变型报告质粒转染到96孔板(1×个/孔)中，转染miR-21模拟物或阴性对照组的EC细胞。用雷尼拉荧光素酶作为内对照。转染48h后，用双荧光素酶报告分析系统(Promega)检测荧光素酶活性。
免疫印迹分析。在Westernblot分析中，用RIPA裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂(中国海门Beyotime生物技术研究所)裂解miR-21模拟/阴性对照的EC细胞，在4?C下14,×g裂解5min，10%SDS-PAGE凝胶分离20μg蛋白质并转移到PVDF膜(孔径0.45M；Milli孔，美国马萨诸塞州比勒里卡)。用脱脂牛奶封闭膜，并与抗PDCD4(1：1,)(编号S；细胞信号技术，美国马萨诸塞州丹弗斯)、基质金属蛋白酶-2(1：)(AB；Abcam，英国剑桥)、基质金属蛋白酶-9(1：)(MAB；微孔)和β-肌动蛋白(1：0)(BM；武汉博斯特生物技术有限公司，中国武汉)在4?C孵育过夜。用增强型化学发光试剂盒(ThermoFisherScience)和化学发光图像分析系统(Tanon5；TanonScience，中国，上海)对蛋白质-抗体复合物进行可视化。
结果
基因芯片筛选候选miRNA。食管癌患者和健康对照血浆微阵列数据已提交到GEO网站，登录号为numberGSE73。用MICR-O-R-R-NA检测，可以区分ESCC患者和正常对照的血浆浓度，为临床诊断和治疗提供了一种新的思路和方法。(2)20m-I-RNA能区分ESCC患者和正常对照的血浆。共发现15个miRNA在ESCC患者血浆中过表达(hsa-miR-16-5p，hsa-miR-a-3p，hsa-miR-15a-5p，hsa-miR--3p，hsa-miR-19b-3p，hsa-miR--5p，hsa-miR-25a-3p，hsa-miR--3p，hsa-miR--3p。HSA-let7i-5p和hsa-miR-)。相比之下，hsa-miR--3p、hsa-miR-、hsa-miR-3p、hsa-miR--3p和hsa-miR--5p表达下调(表I)。基于差异表达的miRNAs的聚类分析成功地分离了ESCC患者和健康对照的血浆样本(图1)。
EC细胞来源的外泌体的运动轨迹。为了检测来自EC细胞的外泌体是否能被受体细胞接受，我们用DiI染料(红色荧光)标记外泌体，如“材料和方法”中所述。将DiI标记的外泌体加入培养基中，在活细胞荧光显微镜下观察到受体EC细胞的红色荧光。外泌体的大小低于衍射极限；因此，DiI标记的外泌体在玻璃上在广场荧光图像上表现为小圆点(24)。我们观察到DiI标记的外泌体从细胞外环境内化到受体EC细胞的细胞质中(图2)。这些研究表明EC细胞来源的外泌体可以被受体细胞接受。
细胞外miR-21可通过EC细胞来源的外泌体转染到受体细胞。为了确定miR-21能否被供体EC细胞来源的外泌体穿梭，用Cy3标记的miR-21模拟物转染供体EC细胞。另外，将供体细胞的培养液加入受体EC细胞中。供体EC细胞转染48h后，供体细胞miR-21的表达水平较阴性对照组增加71.87倍，成功转染合成的miR-21。流式细胞仪分析结果显示，Cy3标记的miR-21模拟物在培养3h、6h和24h后对受体细胞的转移率分别为60.3%、82.6%和85.0%。因此，Cy3标记的miR-21由受体细胞转移(图3)。图4显示用供体EC细胞的培养液处理的受体EC细胞在荧光显微镜下被荧光标记。RT-qPCR结果显示，miR-21模拟物转染组miR-21的表达水平高于阴性对照组，在受体细胞中的平均倍数变化分别为1.11、1.45和1.67(图5A)，培养上清液中miR-21的表达水平分别为7.64、3.15和1.69(图5B)。结果表明，miR-21由供体EC细胞分泌，并通过外泌体导入受体EC细胞。
NSMase抑制EC细胞衍生外泌体的释放。最近的报告显示，miRNAs可以被整合到外泌体中，并通过神经酰胺依赖的途径释放(25)。神经酰胺是一种脂肪酸分子，其生物合成受nSMase2调控，nSMase2可以水解鞘磷脂生成神经酰胺，并触发外泌体的萌发(26)。在本研究中，为了评估miR-21的分泌是否依赖于外泌体转移，我们对在EC细胞中加入nSMase2抑制剂GW，检测供体细胞及其培养液中miR-21的表达水平。作为这种处理的结果，miR-21在细胞外(图6A)和细胞内(图6B)的表达水平在不同的GW浓度下是剂量依赖的。细胞外miR-21的表达随GW浓度的增加而降低，而细胞外miR-21的表达则随GW浓度的增加而增加。这些发现是基于与对照组的比较得出的。这些数据表明，GW处理降低了外泌体穿梭miR-21的表达水平。
外周穿梭miR-21促进受体细胞迁移。如材料和方法中所述，使用8μM孔传输井检测细胞迁移试验。通过共培养模型检测转染miR-21的供体EC细胞来源的外泌体在受体细胞上的潜在迁移能力。结果显示，与miR-21转染的供体EC细胞共培养时，受体细胞相对于miR-NC转染组的迁移增强，平均倍数变化为1.54(图7)。这些数据表明，来源于表达miR-21的供体EC细胞的外泌体可以转移到受体细胞并影响其迁移。
穿梭于外周小体的miR-21可促进受体细胞的侵袭。在侵袭性分析中，细胞共培养使用8μM孔Transwell和Matrigel涂层插件，如材料和方法中所述。通过共培养模型检测转染miR-21的供体EC细胞来源的外泌体在受体细胞上的潜在生物学功能。结果表明，与miR-21转染的供体EC细胞共培养，与miR-NC转染组相比，受体细胞的侵袭力增强，平均倍数变化为1.08(图8)。我们的结果表明EC衍生的外泌体穿梭miR-21可以转移到受体细胞并影响其侵袭能力。
外泌体穿梭miR-21通过与3‘-UTR结合来抑制PDCD4蛋白的表达。为了确定供体细胞来源的外泌体穿梭miRNA是否对其在受体细胞中的目标基因发挥调节作用，我们检测了PDCD4的表达，这是一个预测的miR-21(27-29)的目标基因。正如TargetScan预测的那样，PDCD4的3‘-UTR区域包含miR-21结合位点，与七聚种子匹配(图9A)。用荧光素酶报告基因检测PDCD4是否为miR-21的直接靶基因。结果表明，在EC细胞中过表达miR-21显著降低了pmiR-Report-WT-PDCD4质粒的荧光素酶活性，降低了25.1%。然而，这一过程没有改变pmiR-report-mut-PDCD4的荧光素酶活性。这些结果表明miR-21直接与PDCD4基因的3‘-UTR结合(图9B)。免疫印迹法检测共培养24h后受体EC细胞中PDCD4蛋白的表达水平。图9C显示了来自共培养模式下，MIR-21转染EC细胞PDCD4蛋白表达显著下调，受体细胞减少22.27%。RT-qPCR检测PDCD4的RNA水平。结果显示，在miR-21模拟物和阴性对照组之间，PDCD4mRNA的表达没有统计学意义的变化(P0.05；图9D)。这些结果表明，供体EC细胞分泌的miR-21能被受体EC细胞有效摄取，并在转录后水平调节受体细胞PDCD4的表达。
MIR-21过表达可增加MMP-2和MMP-9的表达。检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在食管癌细胞转移过程中的表达，探讨外膜重排miR-21对食管癌细胞迁移和侵袭的调控作用。RT-qPCR检测共培养后受体细胞MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表达水平。与miR阴性对照组相比，miR-21模拟物组MMP-2mRNA和MMP-9mRNA表达水平分别增加11.24倍和1.76倍(图10A和B)。Westernblot检测共培养后受体细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平。与miR阴性对照组相比，miR-21模拟物组MMP-2和MMP-9蛋白表达水平分别增加13.84倍和5.83倍(图10C和D)。这些数据表明，穿梭于外泌体的miR-21在翻译水平上抑制靶PDCD4的表达，并在JNK下游信号通路中发挥重要作用，参与肿瘤的迁移和侵袭。
外泌体穿梭miR-21与食管癌发病关系的病例对照研究。表2显示了ESCC患者和健康对照组的吸烟状况、饮酒情况和家族史。癌症患者和对照组的平均年龄没有显著差异。吸烟、饮酒和癌症家族史的分布在统计学上有显著差异。患者和健康对照。配对t检验用于评估食管癌患者和健康对照血浆的差异。表三显示，与健康对照组的血浆相比，患者血浆中miR-21的相对表达上调了2.95倍。条件Logistic回归分析显示，miR-21表达增加与食管癌发病风险显著相关(OR，1.；95%CI，1.~1.21；P=0.)。绘制受试者工作特征(ROC)曲线，观察外泌体穿梭miR-21对ESCC患者和健康对照的区分能力。曲线下面积用来衡量辨别程度。如图11所示，循环中的miR-21区分食管癌和健康人的曲线下面积(AUC)值为0.60。
讨论
越来越多的证据表明，肿瘤微环境在肿瘤的发生和发展中起着重要作用(30)。细胞间的交流是一种不可或缺的动态机制，它导致正常的细胞活动和组织内稳态的维持(31)。细胞间的通讯机制如下：1)完整的膜蛋白介导的细胞与细胞的直接接触；2)通过细胞外基质的间接接触；3)通过胞外泌体或细胞外miRNA(如细胞外微环境中与AgO2结合的miRNA)循环miRNA(19)。近年来，肿瘤细胞来源的外泌体在肿瘤微环境的细胞间通讯中的作用逐渐显现。研究表明，外泌体可以通过内吞作用内化到细胞内，但不能并入质膜(24)。我们应用3D活细胞成像系统的细胞培养箱来观察外泌体的转移过程。我们的结果表明，DiI标记的外泌体可以被EC细胞从细胞外环境带入细胞质。研究表明，从内体成分释放的微囊或与质膜融合的微囊可以通过受体介导的相互作用或通过传递生物信息分子，如miRNAs(32)直接影响靶细胞。研究表明，将外泌体衍生的独特miRNA转移到受体细胞是一种替代机制，它涉及细胞与细胞的直接接触或化学受体介导的事件，这些事件允许细胞之间基于基因的交流(16)。在巨噬细胞来源的微泡中发现的miRNAs不仅可以穿梭到单核细胞，也可以穿梭到其他细胞系。因此，巨噬细胞衍生的微泡可以与不同类型的细胞沟通，包括同种异体细胞或与供体细胞不同的细胞类型；这一发现意味着广泛的影响(33)。Shimbo等(34)发现，转染骨髓间充质干细胞(MSCs)的合成miR-被包裹在外泌体中。MSC来源的外泌体形成的miR-可以转移到骨肉瘤细胞，并可能影响骨肉瘤细胞的迁移。一项关于乳腺癌的研究表明，在共培养系统中，巨噬细胞释放的外泌体中的miR-可以通过MEFC-β-catenin途径促进乳腺癌细胞的侵袭(23)。因此，在供体细胞转染后，miRNA可能被分泌并通过外泌体传递到受体细胞中。这些分泌的miRNAs可能通过调节其靶基因的表达来改变受体细胞的细胞功能。这一过程可能在调节肿瘤微环境中发挥重要作用。
MIR-21被认为是一种肿瘤，被证明在许多肿瘤组织、细胞或肿瘤患者的体液中过表达(35-37)。关于miR-21在肿瘤发生发展中的作用已有大量研究。这些研究表明miR-21可以通过靶向PTEN、PDCD4、RECK、FASL和TIMP3(38-40)来促进多种肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭和转移。Hiyoshi等(41)发现，抑制microRNA-21可以通过增加PDCD4蛋白的表达来降低食管鳞状细胞癌细胞系的增殖和侵袭能力。而不会通过与PDCD4-3‘非翻译区结合而改变PDCD4mRNA水平。这一发现表明，microRNA-21在转录后水平以PDCD4为靶点，调节食管鳞状细胞癌的细胞增殖和侵袭。在本研究中，我们用Cy3标记的miR-21转染供体EC细胞，通过流式细胞仪和RT-qPCR检测表明miR-21能有效地从供体细胞转移到受体细胞。NSMase2可以水解鞘磷脂生成神经酰胺并触发外胚体萌发(23，42)。在对nSMase2和肿瘤来源的外泌体的研究中发现，nSMase2在癌细胞中的表达水平高于非癌细胞，并且外泌体的分泌水平与nSMase2(43)的表达水平相关。在本研究中，我们利用nSMase2抑制剂GW证实miR-21的分泌是一个外泌体依赖的过程。结果表明，随着外泌体分泌的抑制，培养上清液中miR-21的表达水平逐渐降低。上述发现表明miR-21可以通过外泌体在细胞间穿梭，为研究miR-21在肿瘤细胞间的通讯功能提供了可能。
随后，我们构建了Transwell共培养系统来模拟肿瘤微环境，并通过Transwell插入实验证明外周穿梭miR-21促进了受体EC细胞的迁移和侵袭。肿瘤抑制基因PDCD4在多种肿瘤组织和细胞中低表达(44，45)。PDCD4被TargetScan预测为miR-21靶基因，是肿瘤增殖、凋亡、黏附、迁移、侵袭和转移(28-30，40，46)的关键调控因子。肿瘤侵袭是一个多步骤的过程，细胞运动与蛋白水解相互作用，细胞与细胞外基质(ECM)相互作用。MMP-2和MMP-9以潜伏酶的形式释放，能够降解参与侵袭过程的ECM。研究表明，这些酶通过去除粘附位点、裂解细胞-细胞或细胞-基质受体以及从细胞外基质释放趋化物质来参与细胞迁移(47，48)。经miR-21抑制剂处理后，U87MG胶质母细胞瘤细胞的侵袭力受到抑制，其机制可能与上调PDCD4表达和下调MMP-2蛋白表达有关(49)。朱等(50)发现抑制miR-21的表达通过miR-21-PDCD4-AP-1反馈环抑制细胞的迁移和侵袭，该反馈环参与了几个关键的下游信号通路分子，如磷酸化的c-jun、MMP-2和MMP-9。另一项关于肝细胞癌的研究发现，PDCD4的过表达抑制了JNK的活性，而且JNK的抑制导致磷酸化的eIF4E的抑制，这可能通过调节MMP的表达来影响肿瘤的侵袭(51，52)。在本研究中，我们证明了来自供体细胞的外泌体穿梭miR-21下调了受体细胞中PDCD4的表达，并增加了受体细胞中MMP-2和MMP-9的下游信号水平。我们的结果提示，外显子介导的信号传递对PDCD4表达的调节和下游信号的调节可能为肿瘤的进展提供了一种新的机制。
一些研究发现，外泌体miRNAs可以分泌到血浆中，可能成为诊断不同癌症类型的潜在生物标志物。对卵巢癌外泌体miRNAs的研究表明，细胞内和外泌体miRNAs中miR-21、miR-和miR-A等8个microRNAs的表达水平相似，相关系数在0.71~0.90之间。因此，肿瘤外泌体miRNAs可以作为活检图谱的替代诊断标记物(15)。另一项对食管癌血清外泌体的研究表明，提取外泌体后残留的血清中未检测到miR-21；这一结果表明，肿瘤细胞的外泌体是食管癌患者血清循环miR-21的主要来源(43)。Ogata-Kawata等人(53)发现TNMⅠ期结直肠癌患者血清中7种外泌体miRNAs(let-7a、miR-、miR-、miR-、miR-21、miR-和miR-23a)的含量明显高于健康对照组，提示血清外泌体miRNAs可作为大肠癌早期诊断的重要生物标志物(53)。一项胰腺癌研究发现，晚期胰腺癌和转移性胰腺癌患者血清外膜miR-17-5p和miR-21显著升高，其诊断敏感性和特异性分别为72.7%和92.6%，miR-21分别为95.5%和81.5%(54)。在本研究中，通过对食管癌患者和健康对照血浆的微阵列分析，确定了20个能够区分食管鳞癌患者和健康对照血浆的miRNAs。在这些miRNA中，miR-25-3p、miR-93-5p、miR-21-5p和miR-在各种癌症患者的癌组织和血浆/血清中表达上调，并被证实是癌基因。MiR-16-5p、miR-a-3p、miR-15a-5p、miR--3p、miR-19b-3p、miR-和let-7I-5p可能是不同肿瘤的促进剂或抑制子，其表达水平存在差异。很少有人研究miR--5p、miR--3p、miR-、let-7d-3p、miR--3p、miR-、miR--3p、miR--3p和miR--5p。本研究结果表明食管癌患者血浆中miR-21表达明显上调。此外，miR-21与食道癌风险之间存在显著的相关性。这些发现表明，血浆中穿梭于外周小体的miR-21的增加可能是食管癌诊断和高危人群筛查的候选生物标志物。
综上所述，我们已经认识到食管癌细胞摄取外泌体的过程，并发现Cy3标记的miR-21模拟物可以通过外泌体在食管癌细胞之间转移。此外，我们的结果显示miR-21模拟物可以通过调节其靶基因PDCD4及其下游信号分子MMP-2和MMP-9在细胞共培养系统中影响受体细胞的迁移和侵袭。作为一种新的细胞间通讯机制，外泌体穿梭miR-21的转运是对经典机制的补充，在肿瘤微环境中的有效转运可能会影响食管癌细胞的状态，从而促进食管癌的复发和远处转移，从而促进食管癌的复发和远处转移。提示外泌体穿梭miR-21可能成为食管癌诊断的潜在生物标志物。
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇