部分一：甘露糖通过抑制肿瘤细胞的代谢（尤其是葡萄糖的代谢）进而阻碍细胞的生长和增殖
已有研究表明，相较于正常细胞，肿瘤细胞对葡萄糖的摄取较强，主要表现在拥有更多的葡萄糖转运蛋白(Regulationofcancercellmetabolism.doi:10./nrc)。因此，研究人员试图证实肿瘤细胞对于不同类型的糖是否会产生不同的响应，从而检测了其它糖对肿瘤细胞生长的影响。结果显示甘露糖能在多种肿瘤细胞系中抑制肿瘤细胞的生长，且在人骨肉瘤细胞U2OS中较为显著。
（a）对照或添加25mM己糖的U2OS-E1a细胞的生长曲线。(b，c)在对照（-甘露糖）或给与25mM甘露糖（+甘露糖）中Saos-2、KP-4细胞的生长曲线（其余还包括PA-TU、K、A、SKOV3、RKO细胞）。
对于其中的机制，研究人员首先推测，由于甘露糖是通过与葡萄糖相同的转运蛋白进入细胞的，因此甘露糖可能会干扰葡萄糖的摄取。后续实验证明，尽管观察到甘露糖可提高磷酸化AMPK水平，但LC-MS分析表明葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖2-DG-P的磷酸化水平（用于评估葡萄糖吸收）与细胞株对甘露糖的敏感性无关。
（e）Western印迹显示U2OS-E1a的对照组与25mM甘露糖给药组5、15、30和45分钟后，磷酸-AMPKα（T）和总AMPKα的水平。（f）25mM甘露糖给药后SKOV3和RKO细胞的生长曲线。（g）在培养基中存在25mM甘露糖6h的情况下，用10mM2-脱氧葡萄糖孵育的RKO，SKOV3，SAOS-2和U2OS细胞中2-DG-P的水平。
但实际上，甘露糖确实增加了己糖-6-磷酸的胞内含量，这是葡萄糖和甘露糖代谢后第一步产生的，而其他糖没有观察到这种效果（扩展数据图1i）。为了确定己糖-6-磷酸水平升高是由于甘露糖还是葡萄糖引起的，研究人员用标记有两个13C原子的葡萄糖和标记了6个13C原子的甘露糖处理了细胞，以便检测分子量差异。结果发现甘露糖不但会增加甘露糖胞内含量，也会增加葡萄糖胞内水平。由于甘露糖不会降低胞内葡萄糖水平，但会显着影响细胞生长，因此研究人员又推测甘露糖可能会干扰葡萄糖的代谢。甘露糖-6-磷酸可以抑制三种介导葡萄糖代谢的酶：己糖激酶（HK）、磷酸葡萄糖异构酶（PGI）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。对此进一步测量了在单给甘露糖或葡萄糖及共同给药后己糖-6-磷酸和乳酸的水平，结果表明甘露糖诱导了己糖-6-磷酸的积累，并显着降低了葡萄糖中乳酸的产生。进一步的分析表明，甘露糖不仅影响了糖酵解，还影响了三羧酸循环，戊糖磷酸途径和多糖合成的有关物质，而其它糖对这些代谢作用未体现出如此影响程度。
（d）甘露糖代谢途径：甘露糖以与葡萄糖相同的转运蛋白（GLUT）进入细胞，并被HK磷酸化为甘露糖-6-磷酸（M6P）。然后甘露糖可用于糖基化或通过磷酸甘露糖异构酶（PMI）异构化为果糖-6-磷酸。PMI和PGI均可介导葡萄糖-6-磷酸（G6P）产生M6P。甘M6P还参与脱氨基神经氨酸（KDN）的生物合成。(e，f）提取细胞内代谢物并测量每微克蛋白质中G6P、M6P和乳酸的峰面积.(g–i)细胞内代谢产物甘油3-磷酸甘油醛（GA3-P）、磷酸烯醇丙酮酸（PEP）、α-酮戊二酸（α-KG）、苹果酸、核糖5磷酸和UDPN-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）的每微克蛋白质相对量。
综上结论，甘露糖通过在胞内以甘露糖-6-磷酸的形式积累，从而干扰葡萄糖代谢并抑制癌细胞的生长。
部分二：甘露糖与化疗药物联用能促进肿瘤细胞凋亡，增强化疗效果。
尽管单给甘露糖对肿瘤细胞没有直接的细胞*性，但当与顺铂或阿霉素一起施用时，可显着加剧细胞死亡。
(a，b)在存在或不存在25mM甘露糖的情况下，用10μM顺铂和1/μgml阿霉素处理24小时后，U2OS-E1a和Saos-2中PI阳性细胞的百分比。
从机制上讲，甘露糖和化疗药物的联用增加了聚合酶PARP（半胱天冬酶-3/caspase-3的底物，会诱导细胞凋亡）的水平，该作用能被半胱氨酸蛋白酶抑制剂zVAD-FMK阻断，这提示细胞死亡可能是通过凋亡进行的，因此研究人员使用CRISPR–Cas9基因编辑技术来确定可能涉及的凋亡途径，结果发现，在破坏Bax和Bak蛋白（线粒体外膜通透性和内在途径的关键因素）后，甘露糖联合化疗药物所引发的细胞死亡明显减少。由于线粒体外膜通透性受癌基因Bcl-2家族成员控制，因此进一步检测了这些蛋白的水平，结果发现甘露糖与化疗药联用后，促凋亡蛋白Noxa的水平增加，而抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-XL水平下降，进一步CRISPR介导的Noxa破坏和Mcl-1或Bcl-XL过表达证实了这些蛋白参与了甘露糖和化疗药诱导的细胞死亡。
在有无10μM顺铂、25mM甘露糖、50μMzVAD-FMK的条件下处理24h的（c）U2OS-E1aPI阳性细胞百分比；（d）PARP和caspase-3水平；（e）Bax/BakCRISPRPI阳性细胞百分比；（f）Mcl-1、Bcl-XL和caspase-3裂解的水平。（g，h）Mcl-1和Bcl-XL过表达情况下U2OS-E1aPI阳性细胞百分比。
综上结论，甘露糖与化疗药联用通过下调Mcl-1和Bcl-XL蛋白水平来增强细胞凋亡的内在途径，从而增加细胞死亡。
部分三：甘露糖可在体内抑制肿瘤生长，诱导肿瘤消退。
为了验证甘露糖是否在体内发挥作用，在荷瘤小鼠饮水中加入20%甘露糖，并每周用μL20%的甘露糖水溶液灌胃3次。此外，给小鼠注射18F-FDG（葡萄糖2位的羟基被放射性同位素18F取代，即氟代脱氧葡萄糖），以监测18F-FDG的摄取，结果发现，甘露糖给药的荷瘤小鼠其18F-FDG信号明显降低，且甘露糖给药显着抑制了肿瘤生长，并且小鼠的体重和其他健康指标没受到明显的影响。另外，用甘露糖和阿霉素单独或联用治疗荷瘤鼠后发现，阿霉素或甘露糖都可导致肿瘤体积减小，但将阿霉素与甘露糖联用时观察到更好的效果，且小鼠的预期寿命显着增加。
将CD1裸鼠皮下移植KP-4细胞，并使肿瘤生长14天，肿瘤抑制后第三天给与含20％甘露糖的饮用水，每周三次，（a）进行正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI）扫描，白色虚线圈突出显示了肿瘤区域。（b）测量肿瘤体积；（c）所有治疗组的肿瘤体积；（d）所有治疗组中小鼠的存活率图表，直到实验结束时第73天。
部分四：甘露糖的治疗效果可能可以用PMI的表达来预测。
对于为什么不同细胞对甘露糖的敏感性有所不同，研究人员认为这可能与糖代谢中涉及的顶端酶有关。分析表明，甘露糖敏感性与PMI的水平和活性大致呈负相关，PMI能催化甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸相互转化，因此在三种对甘露糖不敏感的细胞系SKOV3，RKO和IGROV1中敲低了编码PMI的基因MPI，结果显示MPI敲低导致这些细胞系明显对甘露醇的细胞生长抑制作用更加敏感，相反MPI的过表达使细胞系对甘露糖具有抵抗力。最后发现MPI的敲除对甘露糖给药后糖下游的代谢途径有非常显着的影响。接下来，研究人员推测是否可以通过调节PMI从而在体内影响肿瘤对甘露糖的反应。由于免疫微环境在许多治疗情况下都很重要，并且甘露糖会影响免疫细胞功能，因此决定使用具有免疫能力的小鼠和B16-F1和LLC细胞系，结果显示该细胞系正常情况下对甘露醇不敏感，但MPI敲除后对甘露醇敏感。
为了进一步验证PMI是否有可能被用作甘露糖敏感性的生物标记，对来自卵巢癌、肾癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠癌切片的组织微阵列进行了染色。结果表明PMI水平不仅在同一组织的肿瘤之间变化，而且在组织之间也存在变化，其中值得注意的是，大肠肿瘤通常具有非常低的PMI水平，这表明它们可能对甘露糖更为敏感。为了验证这一点，使用了炎症驱动的大肠癌模型和基因工程小鼠模型，在这两种模型中，给与20％甘露糖饮用水的小鼠在临床终点时肿瘤体积显著减少。
（a）蛋白质印迹，显示十个癌细胞系中PMI和ERK2的水平。（b）分别用两个非靶向（NTC）和两个靶向PMI的短干扰RNA（siRNA）瞬时转染48h后，在有无25mM甘露糖的情况下SKOV3细胞的生长曲线。（c）转染后有无25mM甘露糖的情况下己糖-6-磷酸代谢物含量的百分比。（f，g）敲除MPI可使B16-F1和LLC细胞对甘露糖敏感。（h-k）B16-F1或LLC细胞注射后，将小鼠维持在有或无20％甘露糖饮用水的环境中，并随时间监测肿瘤的生长。（l）卵巢、肾脏、乳房、前列腺和结直肠的组织微阵列中MPI表达水平。（m，n）炎症驱动的大肠癌模型和基因工程小鼠模型造模后，直至达到临床终点，在每只小鼠的结肠中计数肿瘤。
讨论
甘露糖代表了一种良好耐受的可干扰葡萄糖代谢的手段，可以单独或与其他形式的癌症治疗结合用于临床。其意义在于抑制了肿瘤细胞葡萄糖代谢途径，开辟了一条新的抗癌道路。但本研究中甘露糖给与的浓度较高，体内灌胃为0.02g/20g，这可能在临床上会导致一系列副作用，因此指望摄入少量甘露糖会抗癌恐怕不太现实。研究人员也表目前尚属于前期研究，他们会继续探索甘露糖的给药方式以尽快进行临床试验。
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