撰文
于珊
指导
梁玉洁
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赵桂溢
紫草素(SHK)是紫草中分离出的一种萘醌类化合物。通过激活坏死通路，对胶质瘤、骨肉瘤、乳腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤等多种癌症发挥治疗作用。MLKL蛋白被认为是程序性坏死的执行者。MLKL被招募到RIP1＆RIP3复合体中，被RIP3磷酸化激活。激活的MLKL可产生多种生物学效应，如破坏细胞膜、诱导质膜内阳离子通道、触发NLRP3炎性小体形成。
研究发现紫草素处理的胶质瘤细胞的胞核在透射电镜下呈透射影，提示紫草素诱导染色质溶解可能是触发胶质瘤细胞坏死的通路。
年9月17日，KeSai和PengfeiGe教授团队众人在CancerLetters杂志发表一篇题为”MLKLcontributestoshikonin-inducedgliomacellnecroptosisviapromotionofchromatinolysis”的文章，发现MLKL通过促进染色质溶解参与了紫草素诱导的胶质瘤细胞坏死，且紫草素诱导MLKL与其上游信号RIP1和RIP3之间的正反馈。
DOI:10./j.canlet..09.
SHK诱导胶质瘤细胞
染色质裂解
透射电镜观察(图1)，对照组细胞核轮廓清晰，含有大量异染色质，与之相比，紫草素处理3小时后的实验组，尽管核膜完好无损，细胞核却变成了电子低密度影。提示紫草素可诱导胶质瘤细胞染色质降解。激光共聚焦显微镜扫描也发现与对照组相比，实验组核DNA染色中细胞核呈中空状态。在此基础上，对紫草素诱导的SHG-44和U细胞的细胞核形态变化进行了动力学分析。当紫草素处理时间从1小时延长到3小时时，空心核占所有计数核的比例有显著提高。
图1｜透射电镜与激光共聚焦显微镜扫描影像
MLKL诱导胶质瘤细胞
发生程序性坏死
越来越多的证据表明紫草素通过激活RIP1和RIP3诱导胶质瘤细胞坏死，但MLKL的作用尚不明确。与对照组相比，紫草处理过的细胞MLKL和p-MLKL的蛋白水平均明显上调，且当孵育时间从30min延长到min时，其水平显著升高。（图2）这表明紫草素对MLKL的激活随着时间延长不断增强。为了研究MLKL激活在紫草素诱导的胶质瘤细胞死亡中的作用，用10μmol/LMLKL抑制剂NSA处理细胞1h，然后与指定浓度的紫草素孵育3h。LDH释放实验表明，NSA预处理可显著防止紫草素诱导的胶质瘤细胞死亡率。表明MLKL能够调节紫草素诱导的胶质瘤细胞坏死。
图2｜MLKL介导SHK的相关实验数据
MLKL促进γ-H2AX形成
γ-H2AX是DNA双链断裂(DSBs)的标记，被认为是导致染色质分解的关键步骤。Westernblotting分析显示，紫草素处理3h后细胞中γ-H2AX水平显著提高，且随着紫草素剂量的增加而增强。MLKL通过ATM的磷酸化或DNAPKcs形成提高γ-H2AX水平。（图3）考虑到ROS可导致DNADSBs，科研人员检测了激活MLKL对紫草素诱导的ROS过量产生的影响。这些结果陆续证实MLKL通过促进ROS的产生加剧了紫草素诱导的染色质分解。
图3｜紫草素处理细胞后γ-H2AX的W-B结果
MLKL诱导AIF核移位
AIF从线粒体转位到细胞核，既可导致细胞凋亡，也可导致坏死性染色质溶解，那么紫草素是否可诱导AIF的核转位呢？Westernblotting分析显示当紫草素处理时间从15min延长到min时，SHG-44、U、U87和C6细胞线粒体内的AIF的减少；细胞核和细胞质内的AIF的明显增加。激光扫描共聚焦显微镜也显示，与对照细胞相比，紫草素处理的细胞中AIF主要积聚在细胞核中（图4）。这表明紫草素可诱导AIF从线粒体释放，并在细W胞核和细胞质中积累。激活MLKL可以也加剧SHK诱导的AIF的核易位。
图4｜紫草素处理后细胞AIF的W-B结果
MLKL激活导致线粒体受损
考虑到线粒体是AIF的正常位置，线粒体释放AIF受线粒体膜电位控制，我们用JC-1染色检测紫草素处理是否会导致线粒体去极化。JC-1在线粒体中积累后呈高红色荧光，当线粒体膜电位耗尽时存在于细胞质中，发出绿色荧光。荧光显微镜和流式细胞术分析显示（图5），紫草素以IC50值处理2h后，线粒体膜电位明显降低。激活的MLKL通过改变线粒体膜电位从而扰乱了线粒体功能，导致线粒体超氧化物的过度产生，促进了胶质瘤细胞程序性坏死的发生。
图5｜紫草素以IC50值处理后
体内SHK诱导MLKL活化以及
胶质瘤细胞染色质裂解
为了检测紫草素是否能在体内诱导MLKL激活和染色质溶解，将C6胶质瘤细胞皮下移植到裸鼠的侧腹。紫草素2mg/kg，每2天1次，第8天就可以观察到移植瘤体积明显小于对照组。对肿瘤体积的统计分析也证明紫草素治疗能显著抑制异种移植胶质瘤的生长。
图6｜体内SHK诱导MLKL活化以及胶质瘤细胞染色质裂解
结论
图7｜MLKL介导的通路
我们在本研究中发现紫草素在体外和体内诱导了胶质瘤细胞MLKL激活和染色质溶解，并伴随着AIF的核易位和γ-H2AX的形成。体外研究表明，NSA抑制MLKL或siMLKL可减轻紫草素诱导的胶质瘤细胞死亡和染色质溶解。激活的MLKL靶向线粒体并产生线粒体超氧化物，通过改善细胞内ROS的积累，引起线粒体去极化和γ-H2AX的形成，促进AIF向核的转运。值得注意的是，激活的MLKL还可以通过提高细胞内ROS水平，反向上调CYLD蛋白水平，促进上游通路RIP1和RIP3的激活。
原文：
DOI:10./j.canlet..09.
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李*诗
初版编审
杨乐梁玉洁
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廖贵清
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